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Preparazione dei buffer in laboratorio: soluzioni, calcoli e risoluzione di problemi comuni

Perché una pesata accurata è essenziale per soluzioni buffer di qualità

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Preparazione dei buffer: soluzioni, calcoli e risoluzione di problemi comuni

Buffer Preparation

Buffer Preparation

Preparazione dei buffer: workflow di formulazione
  1. Scegliere la ricetta dal database
  2. Ricalcolare le quantità della ricetta in base al volume di buffer richiesto
  3. Pesare i componenti nel contenitore
  4. Sciogliere i componenti in un solvente idoneo (generalmente acqua)
  5. Verificare e regolare il valore di pH utilizzando un pHmetro
  6. Portare la soluzione al volume richiesto
  7. Trasferire la soluzione in un flacone per la conservazione ed etichettarla
  8. Documentare i risultati

Come funzionano le soluzioni buffer?

I buffer sono sistemi acquosi che resistono alle variazioni di pH quando vengono aggiunte piccole quantità di acido o base e sono composti da un acido debole e dalla sua base coniugata. Un buffer mantiene costante il pH di una soluzione assorbendo i protoni rilasciati durante le reazioni oppure rilasciando protoni quando questi vengono consumati dalle reazioni. L'aver scoperto che soluzioni parzialmente neutre di acidi o basi deboli sono resistenti alle variazioni di pH, quando vengono aggiunte piccole quantità di acidi o basi forti, ha portato al concetto di "buffer".
 

Una base coniugata è un acido che ha perso un protone.
HA  ↔  H+ + A-
Acido  ↔  protone + base coniugata
 

Un acido coniugato è una base che ha guadagnato un protone.
A + H+  ↔  H+A
Base + protone  ↔  acido coniugato
 

Viene stabilito un equilibrio tra la forma dissociata e indissociata.
Ad esempio, un acido acetico debole si dissocia parzialmente in acqua producendo uno ione acetato:
CH3COOH  ↔  H+ + CH3COO-
L'acido acetico indissociato, gli ioni idrogeno e lo ione dissociato sono presenti in equilibrio nella soluzione.
 

Anche l'acetato di sodio si dissocia in acqua per produrre lo stesso ione acetato:
CH3COONa  ↔  Na+ + CH3COO-
L'acetato di sodio indissociato e gli ioni di sodio e acetato sono presenti in equilibrio nella soluzione.
 

Una soluzione acquosa composta da una miscela di acido acetico e acetato di sodio può quindi assorbire gli ioni H+, derivanti dall'aggiunta di un acido, attraverso la combinazione degli ioni idrogeno con la base di acetato per produrre acido acetico. Inoltre, quando gli ioni OH- vengono introdotti nella soluzione mediante l'aggiunta di un alcali, si combinano con le molecole di acido (H+) per produrre acqua. In questo modo, mentre il sistema cerca di ripristinare l'equilibrio, la soluzione resiste alle variazioni del valore di pH. Ecco come funziona una soluzione buffer.
 

Cosa accade dopo l'aggiunta dell'acido al buffer?

Quando un acido forte (più H+) viene aggiunto a una miscela all'equilibrio composta dall'acido debole e dalla sua base coniugata, l'equilibrio si sposta verso sinistra, secondo il principio di Le Chatelier.
 

Cosa accade dopo l'aggiunta di una base al buffer?

Allo stesso modo, se una base forte viene aggiunta alla miscela, la concentrazione di ioni idrogeno si riduce meno del previsto per la quantità di base introdotta. Ciò accade perché l'equilibrio si sposta verso destra per compensare la perdita di H+ nella reazione con la base.

Buffer Preparation Formula

Tipi di soluzioni buffer

Le soluzioni buffer composte da un acido debole e dalla sua base coniugata sono note come buffer acidi e hanno un pH < 7. Un buffer composto da acido acetico (acido debole) e acetato di sodio (base coniugata) è acido e presenta un pH pari a circa 4.75.
Le soluzioni buffer composte da una base debole e dal suo acido coniugato sono note come buffer alcalini e hanno un pH > 7. Un esempio di buffer alcalino è una soluzione acquosa di idrossido di ammonio (base debole) e cloruro di ammonio (acido coniugato) che ha pH pari a 9.25.
 

Cosa considerare per la preparazione di una soluzione buffer

Le soluzioni buffer funzionano meglio quando il loro pH è simile a quello del sistema o della soluzione in esame. Per garantire il corretto funzionamento degli enzimi negli studi sulla biologia umana che li riguardano, è richiesto un sistema adeguato al pH del sangue, ovvero compreso tra 7.35 e 7.45. Un buffer con pH non conforme all'intervallo desiderato influirà negativamente sulle analisi.
 

È quindi necessario essere in grado di preparare soluzioni buffer con un pH specifico ed esistono diversi modi per farlo:

  • Regolazione del pH
    È innanzitutto necessario sciogliere l'acido cristallino o la base cristallina in una quantità d'acqua pari a circa il 60-70% del volume finale richiesto dalla soluzione buffer. Il pH viene controllato e quindi regolato. Se si usa un acido cristallino, il pH viene regolato utilizzando una base che non genererà ioni in grado di interferire con il sistema in esame. Se si usa una base cristallina, il pH viene regolato con un acido adeguato. Una volta ottenuto il pH desiderato, è possibile aggiungere acqua alla soluzione buffer per ottenere il volume richiesto.

  • Miscelazione di soluzioni di acidi o basi
    In questo metodo, una soluzione dell'acido o della base viene miscelata con una soluzione del sale associato. Le concentrazioni delle soluzioni iniziali devono essere identiche a quella della soluzione buffer richiesta. Le soluzioni possono essere miscelate in proporzioni variabili per ottenere diversi valori di pH nel buffer finale. In alternativa, il pH può essere monitorato durante l'aggiunta di una soluzione all'altra.

  • Uso dell'equazione di Henderson-Hasselbach
    L'equazione di Henderson-Hasselbach può essere impiegata per calcolare il pH di una soluzione buffer utilizzando la costante di dissociazione pKa. Quando un acido debole (HA) si trova in soluzione e la dissociazione in ioni idrogeno (H+) e la relativa base coniugata (A-) è in equilibrio, la costante di dissociazione misura la forza dell'acido in questo particolare punto di equilibrio. L'equazione di Henderson-Hasselbach è la seguente: 
  • Buffer Preparation - second formula

    Laddove: pKa è la costante di dissociazione dell'acido debole
    [A-] è la concentrazione della base coniugata all'equilibrio
    [HA] è la concentrazione dell'acido all'equilibrio

    Nel caso in cui la concentrazione all'equilibrio della base coniugata e dell'acido siano uguali, il pH diventa pari alla costante di dissociazione. A questo punto, la soluzione buffer offre la massima capacità tamponante.
    L'equazione di Henderson-Hasselbach viene anche utilizzata per determinare la costante di dissociazione degli acidi deboli mediante la misura diretta del pH
     

Vantaggi dei buffer universali
Le soluzioni buffer universali sono composte da una combinazione di diverse coppie acido-base. Ciò consente loro di mantenere il valore di pH di una soluzione su un intervallo più ampio e, per questo, possono essere impiegate in molte altre applicazioni.

Ulteriori suggerimenti per la preparazione e l'uso dei buffer
 

  • Creare una SOP per la preparazione dei buffer
    È consigliabile documentare il processo di preparazione del buffer e assicurarsi che tutti seguano la stessa procedura per garantire coerenza e riproducibilità. La SOP dovrebbe includere informazioni dettagliate sui materiali usati e sui passaggi esatti, con tempistiche e metodologie, per aggiungere i componenti e misurare il pH. La SOP può anche comprendere molti dei punti menzionati di seguito.
     
  • Indossare indumenti protettivi
    È necessario indossare gli appropriati dispositivi di protezione individuale (DPI), ad esempio occhiali e indumenti protettivi, specialmente quando si lavora con acidi o basi forti.
     
  • Verificare la presenza di contaminazione microbica (in particolare nelle applicazioni biologiche)
    Prima di usare eventuali buffer, verificare la presenza di contaminazione microbica nel contenitore. Le soluzioni buffer con pH pressoché neutro sono particolarmente soggette a contaminazione. È possibile osservare un certo livello di torbidezza nella soluzione o la presenza di contaminanti depositatisi sul fondo.
     
  • Utilizzare correttamente il pHmetro
    Il pHmetro dovrebbe essere regolarmente tarato e sottoposto a manutenzione per garantire misure di pH accurate. È necessario preparare accuratamente l'elettrodo prima dell'uso e utilizzare una soluzione buffer sufficiente a garantire che il diaframma sia immerso correttamente. È importante assicurarsi di attendere che il valore di pH si stabilizzi prima di acquisire la lettura e sciacquare l'elettrodo con acqua distillata subito dopo. Accertatevi di utilizzare il pHmetro a temperatura ambiente oppure un elettrodo con sonda di temperatura integrata.
     
  • Conoscere la temperatura
    Il livello di dissociazione può variare con la temperatura. La soluzione buffer deve quindi essere preparata alla stessa temperatura prevista per le analisi. È inoltre necessario assicurarsi che la temperatura alla quale viene eseguita la taratura dell'elettrodo sia la stessa durante la misura.
     
  • Conoscere la concentrazione
    Una pratica diffusa è quella di diluire le comuni soluzioni buffer fino alla concentrazione richiesta per le analisi. Tuttavia, la variazione della concentrazione può influire sul livello di dissociazione. Dato che il pH è una misura degli ioni idrogeno (H+), un cambiamento nella dissociazione può determinare una variazione del pH. A seguito della diluizione, il pH deve essere ricontrollato prima dell'uso del buffer.

Esperta nella preparazione dei buffer

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Domande frequenti sulla preparazione di soluzioni buffer


 

1. Come posso rendere più efficiente la pesata per la preparazione dei buffer?

 

Sulle bilance XPR/XSR di METTLER TOLEDO si possono salvare i propri metodi di pesata specifici. Per la preparazione dei buffer, ciò è possibile utilizzando il metodo della "formulazione semplice con i modelli" sulla bilancia per memorizzare ogni componente, con il relativo peso target e intervallo di tolleranza, come una ricetta. Una volta avviato il metodo, l'operatore viene guidato in ogni fase della procedura. Non si perde quindi tempo a consultare le ricette sui fogli e viene meno ogni incertezza rispetto alla fase in cui ci si trova. I risultati delle pesate vengono salvati automaticamente e possono essere stampati al termine della procedura, in modo tale da consentire un considerevole risparmio di tempo grazie all'eliminazione della registrazione manuale dei dati.


 

2. Qual è la migliore bilancia per la preparazione delle soluzioni buffer?

La bilancia migliore dipende dai singoli requisiti specifici. È necessario conoscere le quantità massime e minime che si desidera pesare oltre al livello di accuratezza richiesto per le operazioni di pesata (ad esempio qual è il livello di tolleranza o l'errore ammissibile). METTLER TOLEDO offre un servizio gratuito che vi aiuta a scegliere la bilancia ideale in grado di soddisfare i vostri requisiti applicativi. Basta chiedere all'esperto locale una consulenza gratuita sulla bilancia. Lo stesso servizio permette inoltre di stabilire se la bilancia esistente soddisfa i vostri requisiti.


 

3. Durante la preparazione delle soluzioni buffer è necessario registrare moltissimi dati. Come posso evitare di commettere errori? Ho bisogno di una soluzione a prova di errore.

Innanzitutto, è necessario collegare il lettore di codici a barre alla bilancia. In questo modo, sarà possibile registrare elettronicamente gli ID dei campioni, i numeri di lotto, i codici, ecc. Successivamente, è necessario collegare una stampante alla bilancia. Con la linea di stampanti P-5x di METTLER TOLEDO, metadati, data e ora possono essere automaticamente stampati insieme ai risultati al termine della procedura di pesata. Un'opzione alternativa è quella di collegare la bilancia al software da laboratorio LabX, in grado di offrire una gestione completa dei dati, compresi report personalizzabili che possono essere inviati direttamente al sistema LIMS o ERP.


 

4. Come posso essere certo della lettura di pH della mia soluzione buffer?

Per essere certi dell'accuratezza del pHmetro sono necessarie taratura periodica e regolari verifiche. Consultate la guida per maggiori informazioni sulla soluzione di METTER TOLEDO per una semplice taratura del pHmetro. Guardate inoltre questo video: Taratura del pH: una pratica guida operativa.


 

5. Cosa succederebbe se dovessi aggiungere una quantità di un ingrediente maggiore di quella necessaria?

Se si pesa accidentalmente una quantità eccessiva di un ingrediente, è possibile aggiungere ulteriori quantitativi degli altri ingredienti invece di scartare i materiali pesati fino a quel momento. Il calcolo manuale delle quantità può essere complesso e prevede un elevato rischio di errore. Bisogna inoltre ricordare che le quantità aggiuntive richieste possono essere molto ridotte e la bilancia esistente potrebbe non essere adeguata a questo. Potrebbe essere necessaria una seconda bilancia, con un più alto grado di accuratezza e una pesata minima inferiore. Se la bilancia è collegata a LabX, il software è in grado di eseguire tutti i ricalcoli necessari e monitorare l'avanzamento della procedura.