Inaktivacija virusa u bioprocesiranju

Inaktivacija virusa prvi je od obično dva namjenska koraka osmišljena za poboljšanje sigurnosti bioterapijskih proizvoda. Tijekom inaktivacije, svaki virus prisutan u udruženoj i polupročišćenoj terapijskoj suspenziji namjerno se uništava ili naglo postaje nepatogen, obično promjenom okoliša oko virusa kako bi se uzrokovao nepovratan poremećaj i denaturacija virusne strukture.

Obično se to postiže promjenom okoliša oko virusa kako bi se uzrokovao nepovratan poremećaj i denaturacija virusne strukture – npr. kemijskim, fizičkim ili čak energetskim metodama. Uklanjanje virusa odvojeno je i razlikuje se od virusne inaktivacije jer je to komplementarni proces koji dodatno poboljšava sigurnost virusa uklanjanjem ili odvajanjem virusa od proteina ili proizvoda od interesa.

Mnogi bioterapijski proizvodi sadrže ili mogu postati kontaminirani virusima tijekom proizvodnje ili prerade. Patogenost i virusno opterećenje ili količina virusa u tim modalitetima moraju se eliminirati ili ukloniti sredstvima za inaktivaciju i uklanjanje kako bi se spriječilo nanošenje štete pacijentu; Nijedan proces sam po sebi obično nije dovoljan. Dostupne su višestruke metode inaktivacije i uklanjanja virusa u skladu sa specifičnim karakteristikama virusa i vrstom bioterapijskog proizvoda. Mnogi tijekovi rada bioterapijske obrade koristit će kombinaciju komplementarnih metoda za povećanje spektra virusa koji se mogu dovoljno eliminirati.

Deaktivacija
Moguće je više metoda inaktivacije virusa. Najčešći su:

• Metode temeljene na niskom pH – posebno za bioterapijske proizvode kao što su monoklonska antitijela (mAbs)
• Metode na bazi otapala ili površinski aktivnih tvari – obično za polisaharide

Rjeđe korištene metode inaktivacije virusa uključuju pasterizaciju, suhu toplinu i toplinu pare - posebno za proizvode na bazi krvi ili seruma.

Uklanjanje virusa
Dobro dokumentirane metode uklanjanja virusa uključuju taloženje, kromatografiju i nanofiltraciju.

Odabir metoda koje će se koristiti za inaktivaciju i uklanjanje virusa ovisi o veličini, vrsti i labilnosti bioterapijskog proizvoda koji se priprema, metodi (metodama) pročišćavanja koju proizvođač želi upotrijebiti te prirodi i titru virusa koji izazivaju zabrinutost. Struktura i funkcija ljekovite tvari (DS) jednako su važni atributi kvalitete zajedno s virusnom sigurnošću i moraju se cijelo vrijeme procijeniti i održavati. Bilo koja metoda inaktivacije virusa, niskog pH ili površinski aktivna tvar, ima koristi od precizne i istodobne kontrole više kritičnih parametara procesa (CPP); sposobnost koja je potrebna za učinkovito razumijevanje samog procesa i učinka na ljekovitu tvar (DS). Reaktori za kemijsku sintezu omogućuju mapiranje modernog procesa i dosljedan rad unutar definiranog prostora parametara, a također modeliraju prijenos i skaliranje metoda.

Poznato je da na virusnu inaktivaciju bioterapijskih proizvoda s niskim pH utječu pH, vrijeme, temperatura, sadržaj proteina i sadržaj otopljene tvari ili pufera. Mnogi virusi su nepovratno denaturirani i učinkovito uništeni pri pH 5,0–5,5. Ovisno o opsegu virusa koji su ciljani za inaktivaciju i čišćenje, ovaj raspon može biti dovoljan. Međutim, nekoliko virusa s ovojnicom učinkovito se inaktivira samo u pH rasponu 3,5–4.

Mnogi bioterapijski proizvodi mAb zahtijevaju posebno širok spektar klirensa više vrsta virusa, tako da se obično prakticira 'niska' pH meta od 3,5-4 (slika A). Međutim, dugotrajno izlaganje ovom pH rasponu također može oštetiti ili inaktivirati neke bioterapijske proizvode, posebno proteine ili enzime kao što su proteini krvi, inzulin i drugi (slika B). S produljenim izlaganjem pH stresu, proteini i enzimi podliježu značajnoj deamidaciji, denaturaciji i agregaciji. Otopine imunoglobulina (uključujući i IgG i IgM mAb) obično su manje osjetljive od drugih proteina ili enzima pri pH 3,5–5,5 – iako ostaju osjetljive u različitim stupnjevima. Nakon dovoljno vremena u uvjetima inaktivacije virusa, infektivni virusni teret treba učinkovito svesti na najmanju moguću mjeru, međutim, zaostale virusne čestice, krhotine ili drugi sadržaj još uvijek neće biti fizički uklonjeni (slika C).

Za imunoglobulinske mAb proizvode, nizak pH je najčešće korištena metoda za inaktivaciju virusa jer je relativno jednostavna, zadržava mali otisak i obično zahtijeva malo intervencije niti dodatne korake za uklanjanje, za razliku od površinski aktivnih tvari ili drugih otapala. Ipak, odgovarajući i optimalni uvjeti variraju između molekula, kao i potrebnog spektra virusnog klirensa. Stoga se moraju provesti studije za svaku molekulu kako bi se karakterizirao i potvrdio prostor dizajna ili operativne granice u kojima se može dogoditi učinkovita inaktivacija virusa. Te granice i ishod procesa inaktivacije virusa obično se definiraju svim, ili barem izborom, varijabli ili kritičnih parametara procesa (CPP) koji utječu na ishod inaktivacije virusa, a time i na kvalitetu ljekovite tvari (DS). Prepoznavanje i snalaženje u tim čimbenicima pozitivno će utjecati na kvalitetu i količinu proizvoda.

Tradicionalno, studije inaktivacije virusa niskog pH provode se s postavljenim volumenom i koncentracijom otopine imunoglobulina u posudi kao što je čaša uz magnetsko miješanje. Budući da će većina studijskog materijala koristiti otopine imunoglobulina s početnim pH koji je blizu fizioloških uvjeta, studije inaktivacije virusa nastojat će razjasniti parametre dodavanja reagensa. Obično se ručna titracija provodi upotrebom birete ili pipetiranja uz povremeno bilježenje mjerenja pH. Nakon završetka propisanog vremena i drugih zadržavanja parametara u uvjetima niskog pH dovoljnog za inaktivaciju ciljanog sadržaja virusa, otopina lijeka (DS) ili imunoglobulina će se obrnuti titrirati iz niskog pH raspona unutar odgovarajućeg fiziološkog ili blago bazičnog raspona. To služi kao završetak inaktivacije virusa niskim zadržavanjem pH. Ipak, tijekom studije titracije niskog pH za virusnu inaktivaciju, ekstrakcija uzorka potrebna je za izvanmrežnu analizu kako bi se dokumentirali različiti atributi kvalitete kao što su agregacija ili deamidacija metodama kao što je kromatografija s izmjenom veličine (SEC). Iako je preciznost moguća od vještih znanstvenika, proces inaktivacije virusa obično je naporan i pati od prirodnih varijacija, netočnosti i izazova ponovljivosti bilo kojeg ručnog procesa.

Iako je glavna potreba za studijama inaktivacije virusa niskog pH u nizvodnoj bioobradi definiranje opsega dodavanja reagensa i vremena potrebnog za proces, karakterizacija kinetike procesa i utjecaja parametara procesa spajanja također je važna i u konačnici uvjet da se osigura dizajn procesa inaktivacije virusa koji je i robustan i optimiziran. Ipak, praćenje i kontrola temperature često je zanemaren, a samim tim i nekontrolirani parametar tijekom studija razvoja procesa za inaktivaciju virusa.

Ovaj nadzor može biti djelomično posljedica upotrebe pilotskih ili čak komercijalnih proizvodnih sustava koji izvode inaktivaciju virusa u posudama za zadržavanje ili prijenos koji mogu bilježiti, ali ne i kontrolirati temperaturu. Reprezentativnost ljestvice, posebno reprezentativnost miješanja, često je još jedan parametar koji se lako previdi u studijama inaktivacije virusa niskog pH, poput onih koje se provode putem ručnih platformi kontroliranih magnetskim pločama za miješanje. Nedostatak prikupljanja podataka za nešto tako jednostavno kao što je miješanje onemogućuje provjeru jesu li pretpostavljeni uvjeti studije bili točni i dosljedni.

Tretman niskog pH za rad jedinice za inaktivaciju virusa predstavlja potencijalni rizik za agregaciju proizvoda tijekom procesa tijekom daljnje obrade monoklonskog protutijela. Predstavio ga je Hiren D. Ardeshna iz GlaxoSmithKlinea, a u ovoj prezentaciji raspravlja se o potpunom faktorskom eksperimentalnom dizajnu za istraživanje učinka četiri procesna parametra:

• Niska pH krajnja točka
• Vrijeme zadržavanja niskog pH
• Trajanje titracije niskog pH
• Trajanje neutralizacije

Metode inaktivacije virusa otapalom ili deterdžentom obično se koriste protiv virusa s ovojnicom. Korišteni reagensi općenito imaju zanemariv utjecaj na labilnost terapijskog proteina ili protutijela koja su podložna izazovima denaturacije ili deamidacije mogućim nekim metodama niskog pH. Metode liječenja otapalom ili deterdžentom za inaktivaciju virusa imaju mnoge iste potrebe i pokretače kao i metode niskog pH; prvenstveno definirati opseg dodavanja reagensa (u ovom slučaju otapala ili deterdženta) i vrijeme potrebno za postupak. Kao i kod inaktivacije virusa niskog pH, uvjeti se razlikuju između imunoglobulina ili drugih vrsta ljekovitih tvari (DS). Stoga se moraju provesti studije za svaku molekulu kako bi se karakterizirao i validirao projektni prostor ili operativne granice u kojima se može dogoditi učinkovita inaktivacija virusa otapala ili deterdženta. Te granice i ishod procesa inaktivacije virusa slično su definirani kritičnim parametrima procesa (CPP), uključujući temperaturu, sadržaj proteina, sadržaj otapala ili deterdženta, vrijeme u uvjetima inaktivacije, kao i miješanje i učinkovitost homogenizacije otapala ili deterdženta. Prepoznavanje i snalaženje u tim čimbenicima pozitivno će utjecati na kvalitetu i količinu proizvoda.

Iako studije inaktivacije virusa deterdženata ne zahtijevaju isti način titracije reagensa kao studije niskog pH, još uvijek treba procijeniti prostor dizajna kritičnih varijabli. Kao i kod niskog pH, studije inaktivacije virusa koje koriste otapala ili deterdžente tradicionalno karakteriziraju proces u potpunosti ručno. Doziranje i kontrole reagensa slično ovise o točnosti i preciznosti visokokvalificiranih osoba koje istovremeno obavljaju više kritičnih zadataka. Studije o inaktivaciji virusa otapalom ili deterdžentom također su podložne prirodnim varijacijama, netočnostima i izazovima ponovljivosti.

Metode inaktivacije virusa koje se oslanjaju na otapala ili deterdžente općenito zahtijevaju daljnje razmatranje koje se obično ne odnosi na metode niskog pH. Sva dodana otapala ili deterdženti moraju se ukloniti iz otopine ljekovite tvari (DS) ili imunoglobulina i provjeriti odgovarajućom analitičkom metodom. Otapala ili deterdženti obično se uklanjaju kromatografijom ili izmjenom pufera tangencijalnom filtracijom protoka. Uklanjanje dodanih otapala ili deterdženata donekle je analogno svrsi za reverznu pH titraciju od inaktivacije niskog pH u odgovarajući fiziološki ili blago bazični raspon. U velikim razmjerima, puferske ili kromatografske metode vjerojatno bi se odvijale kao kontinuirane ili polukontinuirane jedinične operacije dok se materijal kreće iz spremnika kroz kolonu ili drugu odgovarajuću membranu za izmjenu otapala ili pufera. U razvoju procesa, inaktivacija virusa otapala ili deterdženta vjerojatno će se dogoditi odvojeno i različito od sljedećeg koraka pročišćavanja ili uklanjanja. Kao takav, kontinuitet podataka ili informacija može se pogoršati ovom praksom.

Različiti proizvodi cjepiva podvrgavaju se virusnoj inaktivaciji, uključujući toksoid, rekombinantni protein, podjedinicu, polisaharid, pa čak i nekoliko odabranih cjepiva s česticama sličnim virusu. Opet, odabir odgovarajuće metode virusne inaktivacije uzet će u obzir prirodu bioterapijskog proizvoda, kao i širinu virusa koje je potrebno učinkovito očistiti.

Općenito, potrebno je strogo razmotriti alternativne metode ili prakse kojima se sprječava vanjska virusna kontaminacija za vrste cjepiva kao što su živi atenuirani virusi – gdje je bioterapijski proizvod virusna čestica. Posebne metodologije za takve proizvode mogu uključivati jedan ili više postupaka nanofiltracije ili kromatografije za učinkovito smanjenje vanjskog virusnog opterećenja u odgovarajućim izvorima sirovina. Inaktivirani ili uništeni virusi i dalje mogu biti podvrgnuti odgovarajućem procesu inaktivacije virusa na bazi niskog pH ili otapala ili deterdženta – jer to i dalje može zadržati željeni imunostimulacijski učinak čak i ako je virusni proizvod denaturiran ili na drugi način poremećen.

Metode inaktivacije virusa za oligonukleotidne proizvode ili vrste molekula općenito se ne smatraju potrebnima. To je uglavnom zbog prirode reagensa, reakcijskih uvjeta i metoda obrade koje su dosljedno nepovoljne za viruse. Trenutno se mnogi takvi oligonukleotidni proizvodi u razvoju i proizvodnji prvenstveno pročišćavaju, koncentriraju i formuliraju različitim puferskim izmjenama putem tangencijalne filtracije protoka ili jednom od različitih vrsta kromatografskog odvajanja.

S potrebom za kontinuitetom podataka i elektroničkim zapisima šarži, reaktori za kemijsku sintezu funkcioniraju kao multiplikator sile u procesima inaktivacije virusa kako dizajnom i izvođenjem eksperimenata, tako i olakšavanjem prikupljanja i integriteta podataka. Ortogonalna tehnologija analitičke analize procesa (PAT) premošćuje više aplikacija i tijekova rada, kao što je inaktivacija virusa s razmjenom pufera, i točnije modelira procesne tokove operacija velikih razmjera.

Pogledajte eDemo uživo sa svog posla ili kućnog ureda prema svom rasporedu.

• Pritisnite Play i otiđite; iC softver dinamički reagira na uvjete unutar reaktora. Dosljedno izvršavajte operacije unutar granica protokola za inaktivaciju virusa.
• Snimanje podataka s više senzora, uključujući pH, vodljivost, oksidativni redoks potencijal (ORP) i otopljeni kisik.
• Integrirajte periferne jedinice kao što su pumpe ili vage za gravimetrijski prijenos mase.

In-situ FTIR i Ramanova spektroskopija prate kritične komponente bioprocesa tijekom operacija uzvodne, nizvodne, konjugacijske i formulacijske jedinice.

Glukoza i ključni metaboliti mogu se pratiti u uzvodnim primjenama, dok se u nizvodnim procesima koncentracija proteina ili cjepiva, stabilizatori, pomoćne tvari i nečistoće mogu pratiti i kontrolirati u stvarnom vremenu bez kašnjenja ili troškova povezanih s izvanmrežnom analizom.

To omogućuje brzo određivanje krajnjih točaka procesa, kao i jasno razumijevanje utjecaja različitih parametara procesa na kvalitetu proizvoda i učinkovitost procesa.