Biokataliza i enzimska kataliza

Biokataliza ili enzimska kataliza koristi biološki aktivne komponente za kataliziranje kemijskih transformacija. Biokataliza olakšava spektar primarno ugljikocentričnih reakcija u okruženjima u rasponu od bezstaničnih, potpuno in vitro do procesa posredovanih fermentacijom u živoj staničnoj kulturi.

Biokataliza predstavlja korisnu alternativu tradicionalnoj kemijskoj katalizi iz nekoliko razloga. Enzimske reakcije biokatalizatora:

• Izrazito su kemo-, regio- i enantiospecifični
• Često imaju brzu kinetiku
• Rad u blažim uvjetima od kemijskih katalizatora
• Uklonite problem otpada, toksičnosti i troškova metalnih katalizatora
• Smanjite energetske potrebe povezane s kemijskim reakcijama

Usmjereni inženjering biokatalizatora poboljšava stabilnost otapala na povišenim temperaturama, omogućujući široko usvajanje biokatalize u farmaceutskoj, kemijskoj, biogorivnoj i prehrambenoj industriji.

Preuzmite ovu besplatnu studiju kako biste saznali kako PAT i znanost o podacima u istraživanju, razvoju i proizvodnji procesa biokatalize omogućuju brzu identifikaciju neodrživih putova sinteze, mjerenja kinetičke reakcije te probir i kontrolu parametara procesa.

Biokataliza je povezana sa "zelenom", održivom i isplativom proizvodnjom kemijskih proizvoda. U odnosu na hemokatalizu, biokatalizatori nude inherentne prednosti za sintezu, uključujući:

• Značajna raznolikost spojeva, bilo iz prirodnih ili genetski modificiranih izvora, za rješavanje širokog raspona kemijskih transformacija
• Specifičnost biokatalitičkih reakcija koje ublažavaju potrebu za specifičnim klasičnim strategijama kemijske sinteze/obrade, kao što su korištenje blokovajućih/deblokirajućih skupina, odvajanje enantiomernih smjesa i rad na uklanjanju neželjenih nusproizvoda
• Pojednostavljenje infrastrukture i zahtjeva za sirovinama jer se mnogi procesi biokatalize mogu izvesti u reakcijama u jednom loncu i eliminirati korake reakcije koje zahtijeva tradicionalna kemijska kataliza  

Enzimi koji se koriste u biokatalizi imaju važne i često iskorištavane sposobnosti koje uključuju:

A) Vezanje specifične za funkcionalnu skupinu ili mjesto i prepoznavanje cilja drugih bioloških lijekova ili malih molekula

B) Promicanje udruživanja ili zamjene drugih bioloških lijekova ili malih molekula

C) Strukturne ili elektrostatičke značajke koje olakšavaju transport iona

D) Uređene do neuređenih strukturnih transformacija i, prema tome, različitih katalitičkih aktivnosti

E) Alosterne ili neizravne modifikacije koje induciraju ili potiskuju enzimsku aktivnost

Istraživanje poboljšanih ili modificiranih rekombinantnih biokatalizatora nastavlja proširivati njihovu korisnost u oštroj kemiji, poboljšati opseg reakcije, robusnost enzima i mogućnost ponovne upotrebe. Sada su dostupni prirodni i inženjerski biokatalizatori za izvođenje ključnih kemijskih transformacija kao što su stvaranje C-C veza, amidnih veza, formiranje kiralnih amina i C-H funkcionalizacija.

Opseg enzima koji se koriste za biotransformacije iznimno je širok i obuhvaća gotovo sve industrijske sektore, uključujući prehrambeni, farmaceutski, tekstilni, biogoriva, papir, kemikalije i proizvode za kućanstvo. U sintezi finih kemikalija, farmaceutskih proizvoda i srodnih međuproizvoda, biokataliza (tj. enzimska kataliza ili enzimski posredovana kataliza) brzo je rasla kao tehnologija koja omogućuje razvoj. Enzimi su dostupni za različite biotransformacije kao što su oksidacije, redukcije, dodavanja i eliminacije. 

Šest glavnih klasa enzima i primjeri primjene: 

1. Oksidoreduktaze koje kataliziraju molekularne oksidacije i redukcije. Enzimi monooksigenaze s molekularnim kisikom omogućuju stvaranje C-O veze, a specifični enzimi su projektirani kako bi omogućili oksidaciju alkohola, ketona, aldehida i amina. Što se tiče redukcija, ketoreduktaze (KREDS) i dehidrogenaze omogućuju sintezu enantiospecifičnih alkohola. Drugi enzimi mogu smanjiti veze kao što je C = N, pretvarajući nitrile u amine. 

2. Transferaze su korisne za prijenos funkcionalnih skupina s jedne molekule na drugu. Kinaze i fosfataze (dodavanje i uklanjanje fosfata) posebno su važne za molekularne signalne kaskade, replikaciju DNK, transkripciju RNK i druge funkcije. Postoje i mnoge biološki značajne transferaze koje služe funkcijama, kao što je pretvorba ketona ili aldehida u amine i koje to mogu činiti stereoselektivno.

3. Hidrolaze kataliziraju hidrolizu različitih supstrata. Nukleaze ili proteaze su plodne i esencijalne u recikliranju nukleinske kiseline i peptida. Hidrolaze kao što su lipaza, proteaza i acylaza djeluju kao katalizatori za dodatke Michaela 1,4, koje se široko koriste za stvaranje veza C-C i ugljik-heteroatom.

4. Liaze općenito kataliziraju reakcije stvaranjem ili eliminacijom dvostrukih veza. Za razliku od reakcije supstitucije hidrolazama, reakcije karboksilaze ili dekarboksilaze uobičajene su u farmaceutskoj biokatalizi za dodavanje ili uklanjanje_CO2, kao i C-N liaze koje se mogu koristiti za stvaranje aminokiselina, uključujući supstituirane asparaginske kiseline i alanine.

5. Izomeraze omogućuju preuređivanje atoma u molekuli. Izomeraze, kao što su racemase, invertiraju stereokemiju na ciljnom kiralnom ugljiku, a cis-trans izomeraze kataliziraju izomerizaciju cis-trans izomera u alkenima ili cikloalkanima. Pretvorba glukoze u fruktozu putem glukoze izomeraze predstavlja veliku industrijsku enzimsku biotransformaciju.

6. Ligaze stvaraju nove kemijske veze spajanjem dviju molekula u veću molekulu. Jedna od najvažnijih primjena je upotreba DNA ligaze u stvaranju rekombinantnih molekula DNK i dopuna su endo- ili egzonukleazama.

Proizvodnja enzimskih katalizatora. Općenito, prirodni ili rekombinantni enzimi za biokatalizu prvo se sintetiziraju fermentacijom, najčešće koristeći bakterije, ali povremeno se dobivaju iz kultura kvasca. Iako se enzimi mogu proizvesti u složenijim kulturama stanica sisavaca, bakterije i kvasci obično sadrže dovoljno i prirodnih molekularnih puteva za postizanje presavijanja i umjerenih posttranslacijskih modifikacija potrebnih za rekombinantne biokatalitičke enzime. Enzimi proizvedeni takvim fermentacijama obično se prikupljaju lizom ili drugim poremećajem staničnih struktura kako bi se oslobodili rekombinantni enzimi i dalje se pročišćavaju u procesu sličnom drugim biološkim Lijekova. Fermentacija, žetva i nizvodna obrada predstavljaju vlastite izazove koji se rješavaju korištenjem procesne analitičke tehnologije (PAT).

Stabilizacija i imobilizacija. Imobilizacija enzima koristi se za postizanje stabilnijih, aktivnijih i višekratno upotrebljivih enzima. Općenito, umreženi enzimski agregati (CLEA) mogu se formirati s nekoliko različitih čvrstih supstrata kao što su silicijev dioksid, smole ili polimeri kao što je PEG, pa čak i drugi kompleksi kao što su lipidne nanočestice (LNP). Za neke primjene kemije protoka, CLEA se također mogu formirati na površinama i senzorima kao što su oni koji se koriste u površinskim mjerenjima u analitičke i katalitičke svrhe. Slična rješenja za formulaciju cjepiva i adjuvantne procese rješavaju izazove sinteze povezanih komponenti, adsorpcija, konjugacija ili drugih asocijacija, kao i stabilnosti i formulacije proizvoda.

Hvatanje i izolacija proizvoda. Nakon biokatalize, CLEA se odvajaju od proizvoda i zaostalih reaktanata te se zatim mogu reciklirati ili na drugi način zadržati. Proizvodi malih molekula tada se mogu izolirati filtracijom ili kromatografskim procesima, iako mnogi procesi i dalje favoriziraju metode kristalizacije. Proizvodi za biokatalizu velikih molekula općenito bi nastavili s tradicionalnim tijekovima obrade.

Razumijevanje praktičnog poluraspada i stabilnosti bilo kojeg enzima vezanog za supstrat ili površinski imobiliziranog enzima može biti ključno za dizajn odgovarajućih protokola biokatalize. Razmatranja uključuju:

• Otapala—Mnogi prirodni enzimi bore se s reakcijama organskih otapala. Profil konstruiranih ili rekombinantnih enzima koji se stalno razvija poboljšava kompatibilnost s uvjetima organskih otapala. Rekombinantni enzimi sada su sposobni katalizirati reakcije u okruženjima organskih otapala, na primjer, omogućujući upotrebu modificiranih fosforamidita u sintezi oligonukleotida.
• pH—Enzimi općenito najbolje djeluju unutar uskih pH raspona i toleriraju pH varijacije <0,5 pH jedinica. Stoga je kontrola pH često kritičan parametar za razmatranje za mnoge biokatalitičke reakcije i može biti teško ili zamorno ručno kontrolirati. 
• Temperatura—Prirodni enzimi i njihovi rekombinantni pandani učinkovito funkcioniraju na određenim temperaturama s prilično malim rasponima. Temperaturna odstupanja mogu uzrokovati promjene u kinetici reakcije, prinosu proizvoda ili drugim kritičnim ishodima procesa.
• Otopljeni kisik—Ovaj kritični procesni parametar, posebno važan za reakcije oksigenacije i redukcije, obično se kontrolira raspršivanjem ili doziranjem kisika ili inertnog plina. Optimizacija količine i prijenosa mase otopljenog kisika (uključujući karakteristike mjehurića) u reakcijsku smjesu ključna je kako bi se osiguralo da enzimi oksidoreduktaze mogu raditi s najvećom učinkovitošću.
• Miješanje, dinamika fluida i plinovi—Pravilan aparat za miješanje može uvelike utjecati na životni ciklus biokatalitičkih enzima, posebno tijekom dugog trajanja, kemije protoka ili perfuzijskog stila . Povećanje biokatalitičkih reakcija može biti neoptimalno ako je miješanje nedovoljno karakterizirano. Miješanje je također ključno za pravilnu raspodjelu plina i prijenos mase.
• Reakcijska stehiometrija—Ispravni omjeri reagensa i enzima su kritični i mogu se odrediti studijama dizajna eksperimenata (DoE), automatiziranim kemijskim reaktorima i potpomognutim PAT-om integriranim u razvoj procesa.

Razvoj i povećanje biokatalitičkih reakcija ovisi o prirodi specifičnih biokatalizatora koji se koriste, supstratima, kofaktorima i primijenjenim reakcijskim uvjetima. Kao i u kemijskoj katalizi, ova složena, međuovisna matrica varijabli najbolje se razumije pažljivom kontrolom reakcijskih varijabli u kombinaciji s informacijama iz analitičkih mjerenja u stvarnom vremenu. Međutim, velik dio razvoja procesa, povećanja i ograničenja gustoće podataka za moderne procese povezan je s kontinuiranom ručnom orijentacijom reakcija biokatalize, koje imaju značajne troškove vremena i resursa. Ručni rad podrazumijeva osoblje prisutno u bioreaktoru za gotovo konstantno njegovanje, prilagodbu i uzorkovanje kako bi se zadovoljila sve veća regulatorna i institucionalna potražnja za karakterizacijom procesa i prijenosom tehnologije.

Rad biokatalize bez nadzora moguć je putem platformi za automatizaciju laboratorija koje reagiraju na dinamičke uvjete reakcije kontinuirano mjerene integriranim senzorima i procesnim analitičkim tehnologijama (PAT). Automatizirane platforme reaktora za sintezu olakšavaju brže eksperimentiranje uz minimiziranu ljudsku pogrešku ili intervenciju. Upareni s modularnim, automatiziranim uzorkovanjem reaktora za izvanmrežnu kromatografsku analizu, svi kritični procesni parametri (CPP) mogu se prekriti i trendovati. Podaci o kontroli parametara i procesnoj analitici automatski se bilježe u stvarnom vremenu i strukturiraju za upravljanje podacima i arhiviranje. Smanjena varijabilnost eksperimenta i povećana ponovljivost na različitim razinama reaktora dodatno pojednostavljuju povećanje temeljeno na dokazima.

• Automatizirani reaktori EasyMax i OptiMax imaju važnu ulogu u osiguravanju da se učinak ključnih varijabli biotransformacija, kao što su temperatura, pH, brzine miješanja i doziranje, precizno kontrolira, učinkovito modelira i bilježi. 
• ReactIR i ReactRaman in-situ spektroskopske tehnologije korisne su za praćenje i mjerenje ključnih reakcijskih vrsta u stvarnom vremenu. ReactIR prati ključne analite u otopini bez interferencija suspendiranih čestica kao što su cijele stanice.
• ParticleTrack s FBRM tehnologijommjeri veličinu i distribuciju čestica u heterogenim suspenzijama. EasyViewer snima slike čestica na licu mjesta i provodi analizu slike u stvarnom vremenu o zamućenosti sustava, obliku, veličini, morfologiji, broju i distribucijama.
• EasySampler omogućuje potpuno automatizirano uzorkovanje kemijskih reakcija bez nadzora, uključujući gašenje i razrjeđivanje uzoraka u pripremi za izvanmrežnu analizu.
• Softver za razvoj i skaliranje paketa Scale-up omogućuje brz razvoj, optimalne procese i robusno skaliranje.

Automatizirani reaktor EasyMax cjelovita je radna stanica za optimizaciju parametara u biokatalizi za podršku razvoju, povećanju i izvođenju. Ovaj potpuno automatizirani sustav omogućuje preciznu kontrolu nad procesnim parametrima.

• Upravljajte CPP-ovima, uključujući identifikaciju izvornog materijala, brzine doziranja, temperaturu, miješanje, prostor iznad glave, raspršivanje, mjerenje pH vrijednosti i titraciju
• Lako se integrira s in-situ analizom za biokatalizu, uključujući ReactIR (FTIR), ReactRaman (Raman), ParticleTrack (FBRM), EasyViewer (in-situ analiza slike) i EasySampler (automatizirano, in-situ uzorkovanje reaktora)
• Izvodite eksperimente bez nadzora; Izvršite inteligentno automatizirano uzorkovanje kada je potrebna izvanmrežna analiza
• iC Software omogućuje automatizirano izvođenje i kontrolu svih eksperimenata i periferne opreme, kao i potpuno prikupljanje podataka i vođenje evidencije

ReactIR koristi FTIR spektroskopiju za mjerenje vodenih i organski topivih komponenti u studijama biokatalize. Na mjerenja ReactIR ne utječu suspendirane krute tvari, mjehurići ili druga masa čestica.

ReactRaman koristi Ramanovu spektroskopiju za pružanje molekularne analize čestica i analize reakcija.

• Prati više atributa kvalitete proizvoda na licu mjesta i u stvarnom vremenu u posudi ili tekućem procesu
• Eliminira kašnjenja povezana s uzimanjem uzoraka
• Kvantificira utjecaj koraka obrade na prinos proizvoda i učinkovitost procesa
• Pruža djelotvornu analitiku podataka za donošenje odluka i kontrolu u stvarnom vremenu
• Podržava regulatorne smjernice ICH-a kroz eksperimentiranje i digitalizaciju bogatu podacima
• Pomaže u širenju od istraživanja i razvoja do proizvodnje
• Mjeri koncentracije analita od samo 500 ppm u volumenima od nekoliko mililitara do tisuća litara

ParticleTrack koristi tehnologiju mjerenja refleksije fokusiranog snopa (FBRM) i instrument je temeljen na optičkoj sondi koji se umeće izravno u posudu za praćenje promjenjive veličine čestica i brojanja u stvarnom vremenu. ParticleTrack koristi mjerenja raspodjele duljine tetiva (CLD) za dobivanje raspodjele veličine čestica (PSD).

• Čestice i strukture čestica kontinuirano se prate kako se eksperimentalni uvjeti ili parametri mijenjaju
• Karakterizirati sintezu čestica u čvrstoj fazi, imobilizaciju enzima, cijepanje i srodne morfologije procesa
• Pratite šaržni ili kontinuirani rast proizvoda biokatalize tijekom biokatalize u stvarnom vremenu bez potrebe za uklanjanjem uzoraka
• Karakterizirajte uvjete sustava čestica koji utječu na nukleaciju, obore, polimorfizam i druge atribute sustava

EasyViewer je analizator  veličine čestica temeljen na sondi koji se umeće izravno u posudu za snimanje slika sustava čestica. EasyViewer vrši analizu slike i mjeri broj čestica, raspodjelu veličine i morfologiju iz vremenski razlučivih linijskih slika procesa, omogućujući da populacije budu trendirane tijekom vremena.

• Čestice i strukture čestica kontinuirano se prate kako se eksperimentalni uvjeti ili parametri mijenjaju
• Karakterizirati sintezu čestica u čvrstoj fazi, imobilizaciju enzima, cijepanje i srodne morfologije procesa
• Izmjerite prijenos mase (_{KLA a}) karakterizacijom mjehurića
• Praćenje šaržnog ili kontinuiranog rasta proizvoda biokatalize tijekom kristalizacije u stvarnom vremenu bez potrebe za uklanjanjem uzorka
• Karakterizirajte uvjete sustava čestica koji utječu na nukleaciju, taloženje, polimorfizam i druge atribute sustava

Dizajn eksperimenta (DoE) statistički je korisno sredstvo za minimiziranje broja eksperimenata potrebnih za istraživanje učinka varijabli na izvedbu reakcije u laboratoriju. Ipak, povećanje procesa enzimske katalize do proizvodnje prepuno je problema. Na primjer, mnoge studije biokatalize ne uzimaju u obzir varijable kao što su otapala, pH, temperatura i miješanje u povećanju. Dynochem modeliranje omogućuje uzimanje u obzir važnih fizikalnih i toplinskih svojstava u povećanju. Kada se kinetičke informacije koriste s Dynochem modeliranjem, mogu se odrediti prikladne krajnje točke uzorkovanja za procese biokatalize, čime se štedi vrijeme i resursi. Dakle, Dynochem modeliranje poboljšava razvoj kritičnih parametara procesa i učinkovitog prostora za dizajn procesa.