Kuwety do spektrofotometrów

Kuweta służąca do pomiaru próbki stanowi część układu optycznego spektrofotometru. Dlatego położenie, geometria i stan kuwety mają wpływ na dokładność i precyzję pomiaru absorbancji i powinny być starannie kontrolowane.

Długość ścieżki optycznej kuwety to odległość, jaką przebywa światło między ścianami wewnętrznymi kuwety.

W standardowej kuwecie spektrometrycznej ścieżką światła lub długością ścieżki będzie odległość wewnętrzna od okna przedniego do okna tylnego. Długość ścieżki optycznej standardowej kuwety wynosi 10 mm.

Materiał kuwety może wprowadzać do wyników własną absorbancję zależnie od długości fal. Kuwety kwarcowe są całkowicie przezroczyste w całym widmie pomiarowym (UV-Vis). Plastikowe kuwety jednorazowego użytku dość często są przezroczyste tylko w zakresie widma światła widzialnego. Dlatego o wyborze kuwety decyduje głównie aplikacja.

Według prawa Lamberta-Beera absorbancja jest wprost proporcjonalna do długości ścieżki optycznej kuwety i stężenia próbki. Wybór idealnej długości ścieżki (np. od 1 mm do 5 cm) pozwala wyeliminować potrzebę stosowania rozcieńczeń. Absorbancja mieszcząca się w przedziale od 0,2 A do 1,5 A daje najdokładniejsze wyniki. Do próbek o bardzo wysokim stężeniu idealne są instrumenty mikroobjętościowe o bardzo krótkiej ścieżce (1 mm lub 0,1 mm).

Między pomiarami najlepiej pozostawić kuwetę w uchwycie. Jeśli kuweta jest wyjmowana, należy dopilnować, aby po umieszczeniu jej w uchwycie zawsze była zwrócona w tę samą stronę, tzn. etykietą do źródła światła. Takie postępowanie zapewni, że efekty optyczne będą identyczne w przypadku pomiaru odniesienia i pomiaru próbki.

Aby wyniki były jak najlepsze, pomiar odniesienia i pomiar próbki należy wykonać przy użyciu kuwety tego samego rodzaju.

Kuwety muszą mieć okna wykonane z materiału, który jest transparentny w obszarze widmowym istotnym dla pomiaru.

Aby wyniki pomiarów w widmie UV były jak najlepsze, należy używać szkła transparentnego dla światła UV, na przykład szkła kwarcowego lub szkła SUPRASIL^®.

SUPRASIL^® jest znakiem towarowym firmy Heraeus (dla szkła kwarcowego).

Do widma widzialnego (>400 nm) często stosuje się kuwety szklane lub jednorazowego użytku wykonane z polimetakrylanu metylu (PMMA) lub polistyrenu (PS).

Kuwety jednorazowego użytku wykonane z polimetakrylanu metylu pochłaniają widmo UV i działają jak filtr odcinający, przez co pomiary w widmie UV stają się niedokładne. Dlatego należy je brać pod uwagę tylko w przypadku pomiarów w widmie widzialnym.

Próbkę przed użyciem należy dobrze wymieszać, zwłaszcza w przypadku resuspendowania kwasów nukleinowych lub białek. Należy unikać napełniania kuwet za pomocą pipet szklanych, ponieważ mogą zarysować powierzchnię optyczną. Idealnie do tego celu nadają się pipety z końcówkami jednorazowego użytku wykonanymi z tworzyw sztucznych. Roztwór powinien spływać do kuwety po szklanej ściance, aby nie tworzyły się pęcherzyki powietrza. Przy napełnianiu nie przekraczać 80% pojemności.

Okna kuwety, przez które przechodzi światło, należy czyścić przed każdym użyciem. Należy je starannie wyczyścić po stronach wewnętrznej i zewnętrznej 60-procentowym roztworem izopropanolu w wodzie dejonizowanej, po czym wytrzeć ściereczką do czyszczenia optyki lub tkaniną niepozostawiającą włókien (aby włókna nie zarysowały powierzchni).

Aby absorbancja kuwet nie uległa zwiększeniu, należy je starannie czyścić przed użyciem i po nim. Ponadto należy uważać, aby nie dotknąć okien po zakończeniu czyszczenia. Próbkę należy usunąć niezwłocznie po pomiarze, aby zapobiec uszkodzeniu kuwety przez parujące rozpuszczalniki.

Pomiary zapewniają wyższe wartości absorbancji wtedy, gdy na oknach kuwety obecne są śladowe zanieczyszczenia, takie jak odciski palców lub zatłuszczenia, ponieważ występuje dodatkowy komponent pochłaniający światło. Można temu zapobiec, starannie czyszcząc kuwetę przed użyciem i po nim. Ponadto należy bardzo uważać, aby nie dotknąć okien po zakończeniu czyszczenia.

Kuwetę należy chwytać tylko za ściany szronione, uważając przy tym, aby nie pozostawiać na niej odcisków palców.

Kuwetę należy ustawić stroną transparentną na drodze wiązki światła, pamiętając, aby kuweta z roztworem odniesienia i kuweta z próbką zwrócone były etykietą w tę samą stronę. Należy upewnić się, że kuweta nie jest przechylona i jest całkowicie unieruchomiona w uchwycie. Kuweta nie może się w ogóle poruszyć.

Aby ograniczyć parowanie rozpuszczalnika lub absorpcję wody z otaczającego powietrza w przypadku próbek hydrofilowych, należy skorzystać z pokrywki dostarczanej w komplecie z kuwetą.

Cele przepływowe zawsze należy całkowicie opróżniać po serii pomiarów. Aby nie doszło do powstania osadu wapiennego na oknie optycznym, wnętrze celi przepływowej należy przepłukać acetonem, a następnie bardzo dokładnie wysuszyć w celu usunięcia wszelkich pozostałości acetonu.

W przypadku przechowywania krótkotrwałego można skorzystać z dostępnych specjalnych uchwytów na kuwety. W przypadku przechowywania długotrwałego należy skorzystać z dostarczonej skrzynki, aby nie dopuścić do zarysowań i gromadzenia się kurzu na szklanych powierzchniach.

Między pomiarami najlepiej pozostawić kuwetę w uchwycie. Jeśli kuweta jest wyjmowana, należy dopilnować, aby po umieszczeniu jej w uchwycie zawsze była zwrócona w tę samą stronę, tzn. etykietą do źródła światła. Takie postępowanie zapewni, że efekty optyczne będą identyczne w przypadku pomiaru odniesienia i pomiaru próbki. W przypadku kuwet Excellence METTLER TOLEDO dzięki niezrównanym tolerancjom wykonania nie ma konieczności stosowania tej preferowanej orientacji, ponieważ różnice w absorbancji przy zmianie ustawienia o 180 stopni są marginalne.

Gdy na oknach kuwety obecne są śladowe zanieczyszczenia, takie jak odciski palców lub zatłuszczenia, pomiary dostarczają wyższych wartości absorbancji, ponieważ występuje dodatkowy komponent pochłaniający światło. Można temu zapobiec, starannie czyszcząc kuwetę przed użyciem i po nim. Ponadto należy bardzo uważać, aby nie dotknąć okien po zakończeniu czyszczenia.

Kuweta to niewielkie prostopadłościenne naczynie do próbek wodnych. Ma proste ściany wykonane z bezbarwnego, przezroczystego materiału. Kuwety bywają nazywane także celami. Kuwety wykorzystuje się w spektrofotometrii do mierzenia absorbancji fal o określonej długości.

Jeśli na szlifowanym obszarze kuwety widoczne są zarysowania lub drobne spękania, nie należy już jej używać do pomiarów, ponieważ wyniki będą zafałszowane lub sama kuweta pęknie wewnątrz spektrofotometru. Każdy materiał żywiczny, jaki zostałby użyty do naprawy lub sklejenia kuwety, spowodowałby obniżenie jakości pomiarów. Dlatego odradza się naprawę uszkodzonej kuwety.

Kuweta odniesienia służy do wzorcowania odczytów spektrofotometru przed wykonaniem pomiaru nieznanego roztworu. Odczyt spektrografu stanowi wartości względne do uzyskanych w odniesieniu do kuwety odniesienia. Istnieją czynniki środowiskowe, takie jakie zapylenie, temperatura czy wilgotność, które mogą wpłynąć na odczyt. Aby te zewnętrzne czynniki wyeliminować, odczyty spektrografu dla kuwety odniesienia odejmuje się od odczytów dla kuwety z roztworem stanowiącym badaną próbkę.

Szkło optyczne METTLER TOLEDO: długości fal 320–2500 nm; transmisja światła >80%; wielokrotnego użytku; widmo widzialne (Vis)

Szkło kwarcowe METTLER TOLEDO: długości fal 200–2500 nm; transmisja światła >82%; wielokrotnego użytku; widmo UV i widzialne (UV-Vis)

Najczęściej stosuje się makrokuwety o pojemności 3,5 ml (3500 µl), o standardowej długości ścieżki 10 mm. Objętość kuwety można łatwo wyliczyć według wzoru: długość wewnętrzna × szerokość wewnętrzna × wysokość wewnętrzna × 80%

Pasowana para kuwet to dwie kuwety z tego samego materiału, których ścieżki optyczne są jednakowej długości. Ze względu na ustanowione tolerancje wykonania pary pasowane zapewniają porównywalne wyniki. Kuwety Excellence METTLER TOLEDO charakteryzują się gwarantowanymi tolerancjami wykonania wynoszącymi zaledwie ±0,01 mm, dzięki czemu nie muszą być pasowane.