Virale inactivatie voor bioprocessen

Virale inactivatie is de eerste van meestal twee specifieke stappen om de veiligheid van biotherapeutische producten te verbeteren. Tijdens inactivatie wordt elk virus dat aanwezig is in de samengevoegde en semi-gezuiverde therapeutische suspensie opzettelijk vernietigd of abrupt niet-pathogeen gemaakt. Dit gebeurt gewoonlijk door de omgeving rond het virus te veranderen om een onomkeerbare verstoring en denaturatie van de virale structuur te veroorzaken.

Dit wordt gewoonlijk gedaan door de omgeving rond het virus te veranderen, zodat de virale structuur onomkeerbaar wordt verstoord en gedenatureerd , bijvoorbeeld door chemische, fysische of zelfs energetische  methodes. Virusverwijdering is iets anders dan virale inactivatie, omdat het een aanvullend proces is dat de virale veiligheid verder verbetert door het virus te elimineren of te scheiden van de eiwitten of producten die worden onderzocht.

Veel biotherapeutische producten bevatten virussen of kunnen tijdens de productie of verwerking besmet raken met virussen. De pathogeniteit en de virale lading of de hoeveelheid virus in deze modaliteiten moet geëlimineerd of weggehaald worden door middel van inactivatie en verwijdering om schade aan de patiënt te voorkomen; geen van beide processen op zich is meestal voldoende. Er zijn meerdere methodes beschikbaar voor virale inactivatie en verwijdering, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het virus en het type biotherapeutisch product. Veel biotherapeutische verwerkingsworkflows gebruiken een combinatie van complementaire methodes om het virusspectrum te vergroten dat afdoende kan worden geëlimineerd.

Inactivatie
Er bestaan meerdere virale inactivatiemethodes De meest voorkomende zijn:

• Methodes op basis van een lage pH , vooral voor biotherapeutische producten, zoals monoklonale antilichamen (mAbs)
• Methodes op basis van oplosmiddelen of  oppervlakteactieve stoffen, meestal voor polysachariden

Minder vaak gebruikte virale inactivatiemethodes omvatten pasteurisatie, droge warmte en dampwarmte, vooral voor op bloed of serum gebaseerde producten.

Virusverwijdering
Voorbeelden van goed gedocumenteerde methodes voor virusverwijdering zijn neerslag, chromatografie en nanofiltratie.

De methodes die voor virale inactivatie en verwijdering moeten worden gebruikt, zijn afhankelijk van de grootte, het type en de labiliteit van het biotherapeutische product dat wordt bereid, de zuiveringsmethode(s) die de fabrikant wenst te gebruiken en de aard en de titer van de virussen in kwestie. De structuur en functie van de actieve stof zijn net zo belangrijk voor de kwaliteit als de virale veiligheid. Dit moet gedurende het gehele proces geëvalueerd en gehandhaafd worden. Elke virale inactivatiemethode, lage pH of oppervlakteactieve stof, profiteert van de nauwkeurige en gelijktijdige controle van meerdere kritieke procesparameters; dit is nodig om het proces zelf en het effect op de actieve stof goed te begrijpen. Chemical synthesis reactors  maken het mogelijk om een modern proces in kaart te brengen, evenals een consistente werking in een gedefinieerde parameterruimte. Tegelijkertijd wordt er een model gecreëerd voor methodeoverdracht en -opschaling.

Het is bekend dat de virale inactivatie van biotherapeutische producten met een lage pH wordt beïnvloed door het pH-niveau, de tijd, de temperatuur en het gehalte van eiwitten en opgeloste stof of buffer. Veel virussen worden onomkeerbaar gedenatureerd en effectief vernietigd bij een pH van 5,0-5,5. Afhankelijk van de omvang van virussen die geïnactiveerd en verwijderd moeten worden, is dit bereik meestal voldoende. Er zijn echter enkele specifieke virussen die allen bij een pH-bereik van 3,5-4 worden geïnactiveerd.

Veel mAb-biotherapeutische producten vereisen de verwijdering van een bijzonder groot virusspectrum, waardoor meestal een lage pH-waarde van 3,5-4 wordt toegepast (afb. A). Langdurige blootstelling aan dit pH-bereik kan echter ook bepaalde biotherapeutische producten beschadigen of inactiveren, met name eiwitten of enzymen, zoals bloedeiwitten en insuline, etc. (afb. B). Bij langdurige blootstelling aan pH-stress zijn eiwitten en enzymen onderhevig aan significante deamidatie, denaturatie en aggregatie. Immunoglobuline-oplossingen (waaronder zowel IgG als IgM mAbs) zijn doorgaans minder gevoelig dan andere eiwitten of enzymen bij een pH van 3,5-5,5, ook al blijven ze tot op zekere mate gevoelig. Als de virale inactivatie lang genoeg heeft geduurd, is het resultaat een effectief geminimaliseerde infectieuze virale last. Feit is echter dat de overblijvende virale deeltjes, vuil en andere stoffen nog niet fysiek zijn verwijderd (afb. C).

Bij immunoglobuline mAb-producten is een lage pH de meest gebruikte methode voor virale inactivatie. Dit komt omdat de methode relatief eenvoudig is, weinig plaats inneemt en doorgaans weinig interventie of extra stappen vereist om te verwijderen, in tegenstelling tot oppervlakteactieve stoffen en andere oplosmiddelen. Toch variëren de juiste en optimale omstandigheden tussen moleculen evenals de vereiste verwijdering van het juiste virusspectrum. Daarom moet er onderzoek worden gedaan om elke molecule te karakteriseren en de ontwerpruimte of de operationele limieten te valideren, zodat een effectieve virale inactivatie kan plaatsvinden. Deze limieten en de resultaten van een viraal inactivatieproces worden gewoonlijk gedefinieerd door zo niet alle, dan minstens enkele van de variabelen of kritieke procesparameters die van invloed zijn op de virale inactivatie en dus ook op de kwaliteit van de actieve stof. Het identificeren en aansturen van deze factoren heeft een positieve invloed op de kwaliteit en kwantiteit van het product.

Traditioneel worden virale inactivatie-onderzoeken met een lage pH uitgevoerd op basis van een ingesteld volume en een vaste concentratie van de immunoglobuline-oplossing in een houder, zoals een bekerglas met magnetische roerstaaf. Aangezien het meeste onderzoeksmateriaal immunoglobuline-oplossingen zal gebruiken met een beginnende pH die niet veel van de fysiologische omstandigheden afwijkt, is het doel van het onderzoek naar virale inactivatie om de parameters voor toevoeging van het reagens te verduidelijken. Gewoonlijk wordt een handmatige titratie uitgevoerd met behulp van een buret of pipet, terwijl de pH-meting met tussenpozen wordt geregistreerd. Na een voorgeschreven tijd en andere parameters voor lage pH-condities om het beoogde virusgehalte te deactiveren, zal de actieve stof of immunoglobuline-oplossing omgekeerd worden getitreerd, van het lage pH-bereik tot een geschikt fysiologisch of licht basisch bereik. Hierna is de virale inactivatie door lage pH afgerond. Toch is tijdens het onderzoek naar virale inactivatie door titratie met een lage pH een monsterextractie vereist voor offline analyse om verschillende kwaliteitskenmerken te documenteren, zoals aggregatie of deamidatie, met methodes zoals Size Exchange Chromatography (SEC). Geroutineerde wetenschappers kunnen dit proces met de benodigde nauwkeurigheid uitvoeren, maar het virale inactivatieproces is doorgaans arbeidsintensief. Ook kampt het proces met de normale natuurlijke variaties, onnauwkeurigheden en de reproduceerbaarheidsuitdaging van handmatige processen.

De voornaamste reden voor het onderzoek naar virale inactivatie met een lage pH in downstream bioprocessen is het definiëren van het toegevoegde reagensvolume en de tijd die nodig is voor het proces. Bovendien zijn de karakterisering van proceskinetiek en de impact van samengestelde procesparameters ook van belang. De resultaten worden vereist om te garanderen dat het ontwerp van een viraal inactivatieproces robuust en geoptimaliseerd is. Toch wordt temperatuurbewaking en -controle vaak over het hoofd gezien, waardoor dit een ongecontroleerde parameter is tijdens de onderzoeken naar de procesontwikkeling voor virale inactivatie.

Dit is deels te wijten aan het gebruik van proefsystemen of zelfs in de handel verkrijgbare productie-opschalingsystemen waarbij de virale inactivatie wordt uitgevoerd in (overgangs)vaten die de temperatuur wel kunnen registreren, maar niet kunnen regelen. De representativiteit van de opschaling, in het bijzonder de representativiteit van het mengproces, is nog een parameter die eenvoudig over het hoofd gezien kan worden, met name tijdens de onderzoeken naar virale inactivatie met een lage pH die worden uitgevoerd via handmatige platforms met magnetische roerplaatregeling. Aangezien het mengproces gewoonweg niet wordt geregistreerd, wordt het onmogelijk om te verifiëren of de onderzoeksomstandigheden juist en consistent waren. 

Virale inactivatie met lage pH gaat gepaard met een risico op productaggregatie tijdens de downstream processen voor een monoklonaal antilichaam. Deze presentatie van Hiren D. Ardeshina van GlaxoSmithKline, bespreekt een ‘full factorial’ experimenteel ontwerp om het effect van vier procesparameters te onderzoeken:

• Laag pH-eindpunt
• Lage pH-rusttijd
• Duur van lage pH-titratie
• Duur van neutralisatie titratie

Virale inactivatiemethodes met oplosmiddelen of reinigingsmiddelen worden meestal voor zeer specifieke virussen gebruikt. De gebruikte reagentia hebben over het algemeen een verwaarloosbare invloed op de labiliteit van de therapeutische eiwitten of antilichamen die mogelijk aangetast worden door de denaturatie of deamidatie die gepaard gaat met sommige lage pH-methodes. De behandelingsmethodes met oplosmiddelen of reinigingsmiddelen voor virale inactivatie hebben veel gelijke kenmerken als lage pH-methodes. Het onderzoek gaat voornamelijk naar de hoeveelheid reagens die moet worden toegevoegd (in dit geval een oplos- of reinigingsmiddel) en de tijd die het proces vereist. Net als bij virale inactivatie met een lage pH verschillen de omstandigheden tussen immunoglobulinen en andere actieve stoffen. Daarom moet er onderzoek worden gedaan om elke molecule te karakteriseren en de ontwerpruimte of de bedrijfslimieten te valideren, zodat een effectieve virale inactivatie met een oplos- of reinigingsmiddel kan plaatsvinden. Deze limieten en het resultaat van een viraal inactivatieproces worden op dezelfde manier gedefinieerd door de kritieke procesparameters. Denk hierbij niet alleen aan de temperatuur, het gehalte aan eiwitten en oplos- of reinigingsmiddelen en de tijdsduur van de inactivatiecondities, maar ook aan het mengproces en de effectiviteit van de homogenisatie van de oplos- of reinigingsmiddelen. Het identificeren en aansturen van deze factoren heeft een positieve invloed op de kwaliteit en kwantiteit van het product.

Het onderzoek naar virale inactivatie met reinigingsmiddelen vereist niet dezelfde reagens-titratiemethode als onderzoeken naar lage pH. Desondanks moet nog steeds een ontwerpruimte met kritieke variabelen worden geëvalueerd. Traditionele onderzoeken naar virale inactivatie met oplos- of reinigingsmiddelen karakteriseren het proces volledig op handmatige wijze, net als bij lage pH-methodes. De dosering en regeling van het reagens is ook afhankelijk van de nauwkeurigheid en precisie van zeer vakkundige laboranten die gelijktijdig meerdere kritieke taken uitvoeren. Het onderzoek naar virale inactivatie met oplos- of reinigingsmiddelen heeft ook te maken met natuurlijke variaties, onnauwkeurigheden en uitdagingen op het gebied van reproduceerbaarheid.

Bij virale inactivatiemethodes met oplos- of reinigingsmiddelen speelt nog een factor een rol die doorgaans geen gevolgen heeft voor methodes met een lage pH. Alle toegevoegde oplos- of reinigingsmiddelen moeten van de actieve stof of van de immunoglobuline-oplossing worden verwijderd en vervolgens worden geverifieerd door een geschikte analysemethode. Gewoonlijk worden deze oplos- of reinigingsmiddelen door middel van chromatografie of bufferuitwisseling via een tangentiale flowfiltering verwijderd. Het verwijderen van toegevoegde oplos- of reinigingsmiddelen is enigszins analoog aan het doel van omgekeerde pH-titratie, van een lage pH-inactivatie terug naar een geschikt fysiologisch of licht basisch bereik. Op grotere schaal zullen chromatografische of bufferuitwisselingsmethodes waarschijnlijk als continue of semi-continue eenheidsactiviteiten plaatsvinden, terwijl het materiaal vanuit een vat door een kolom stroomt of door een ander geschikt membraan voor de uitwisseling van oplosmiddelen of buffers. Tijdens de procesontwikkeling zal de virale inactivatie met oplos- of reinigingsmiddelen waarschijnlijk gescheiden en apart plaatsvinden van de daaropvolgende zuiverings- of verwijderingsstap. Door deze procedure wordt de data- of informatiecontinuïteit versterkt.

Verschillende vaccin-producten ondergaan virale inactivatie, waaronder toxoïde, recombinant-proteïne, sub-eenheid, polysacharide en zelfs enkele virusachtige deeltjesvaccins. Ook hier weer moet de selectie van een geschikte methode voor de virale inactivatie rekening houden met de aard van het biotherapeutische product en met het virusspectrum dat op effectieve wijze moet worden verwijderd.

Over het algemeen moet zorgvuldige aandacht worden geschonken aan alternatieve methodes of procedures die externe virale besmetting voorkomen voor vaccin-types zoals verzwakte levende virussen, waarbij het biotherapeutische product een viraal deeltje is. Specifieke methodologieën voor dergelijke producten omvatten vaak één of meer nanofiltratie- of chromatografische processen voor de effectieve externe reductie van de virale belasting in de respectieve grondstofbronnen. Geïnactiveerde of vernietigde virussen kunnen alsnog een geschikt viraal inactivatieproces ondergaan met een lage pH of met oplos- of reinigingsmiddelen. Dit kan namelijk het gewenste immuno-stimulerende effect handhaven, zelfs als het virale product gedenatureerd of op andere wijze verstoord is.

Virale inactivatiemethodes voor oligonucleotide producten of moleculetypes worden over het algemeen niet noodzakelijk geacht. Dit komt voornamelijk door de aard van de reagentia, de reactieomstandigheden en de verwerkingsmethodes die op consistente wijze ongunstig zijn voor virussen. Veel van dergelijke oligonucleotide producten in ontwikkeling en productie worden tegenwoordig voornamelijk gezuiverd, geconcentreerd en gerecepteerd met diverse bufferuitwisselingen via tangentiale flowfiltering of door één van de verschillende chromatografische scheidingsmethodes.

Gezien de behoefte aan data-continuïteit en elektronische batch-records, functioneren chemical synthesis reactors als een krachtversterker bij virale inactivatieprocessen, zowel door het ontwerp en de uitvoering van de experimenten, als door de benodigde dataverzameling en data-integriteit. Orthogonale Process Analytical Technology  (PAT) is geschikt voor allerlei toepassingen en workflows, zoals virale inactivatie met bufferuitwisseling en de nauwkeurigere modelprocesflows van grootschalige processen.

Bekijk een live eDemo op uw werkplek wanneer u dat uitkomt.

• Het enige wat u hoeft te doen is op 'start’ te drukken. De iC-software reageert op dynamische wijze op de omstandigheden binnen de reactor. Voer op consistente wijze processen uit binnen de protocolparameters voor de virale inactivatie.
• Verzamel de data van meerdere elektrodes, waaronder pH, geleidbaarheid, oxidatieve redox potentiaal (ORP) en opgeloste zuurstof.
• Integreer perifere apparatuur, zoals pompen of balansen, voor de gravimetrische massa-overdracht.

In-situ FTIR en raman spectroscopy  traceren de kritieke componenten van de bioprocessen gedurende alle upstream-, downstream-, conjugatie- en receptuurprocessen.

Glucose en belangrijke metabolieten kunnen in upstream-toepassingen worden bewaakt, terwijl in downstream-processen eiwit- of vaccinconcentraties, stabilisatoren, vulstoffen en onzuiverheden in realtime bewaakt en aangestuurd kunnen worden, zonder de vertraging of de kosten van een offline analyse.

Hierdoor is een snelle bepaling van de proces-eindpunten mogelijk, evenals een goed begrip van het effect van verschillende procesparameters op de productkwaliteit en de procesefficiëntie.