Základy UV Vis spektroskopie včetně barevných stupnic, základů, přístrojů a kalibrace.
Prosím, popište svůj projekt. Zavolejte nám pro individuální nabídku /content/cz/cs/home/applications/Application_Browse_Laboratory_Analytics/uv-vis-spectroscopy/uvvis-spectroscopy-explained.fb.1.c.11.html
UV Vis spektroskopie je vědecká technika používaná k měření množství světla, které je absorbováno nebo propouštěno vzorkem při různých vlnových délkách ultrafialového (UV) a viditelného (Vis) světla.
Tento postup zahrnuje prosvícení vzorku paprskem UV Vis světla a měření množství světla, které jím projde. Analýzou vzorce absorpce a propustnosti světla mohou vědci identifikovat a kvantifikovat složky vzorku.
Mezi látkou a jejím UV Vis spektrem existuje jedinečný vztah, kdy látka absorbuje maximum světla při určité vlnové délce. Tento vztah lze využít pro:
Kvalitativní analýzu, tj. určení přítomnosti určitých látek.
Kvantitativní analýzu, tj. stanovení množství určitých látek.
UV vis spektrofotometrie se běžně používá v mnoha vědních oborech, včetně chemie, biologie a fyziky, ke studiu vlastností materiálů a jejich interakcí se světlem. Je také široce využívána v průmyslu pro kontrolu kvality a analýzu materiálů, jako jsou léky, potraviny a kosmetika.
Tato stránka vám poskytne základní znalosti o UV vis spektroskopii a jejích aplikacích.
V následujících kapitolách najdete odpovědi na otázky týkající se základů a aplikací technologie UV Vis:
UV Vis spektroskopie je druh absorpční spektroskopie, při níž je vzorek osvětlován elektromagnetickým zářením různých vlnových délek v ultrafialovém (UV) a viditelném (Vis) oboru. V závislosti na látce jsou UV nebo viditelné světelné paprsky vzorkem částečně absorbovány. Zbývající světlo, tj. prošlé světlo, se zaznamenává jako funkce vlnové délky vhodným detektorem. Detektor pak vytvoří jedinečné UV Vis spektrum vzorku (známé také jako absorpční spektrum).
Chcete-li se dozvědět více o základech UV Vis spektroskopie, stáhněte si příručku METTLER TOLEDO "Aplikace a základy spektrofotometrie".
Když světlo dopadá na objekt, může být objektem absorbováno, obvykle proto, že vlnová délka absorbovaného světla odpovídá elektronické excitaci v objektu. Zbývající světlo je propouštěno, tj. prochází objektem.
Ve spektrofotometru se propustnost měří tak, že se spektrum intenzity světla procházejícího vzorkem (I) dělí spektrem intenzity světla procházejícího slepým vzorkem (I0).
Převodník absorbance/propustnosti
=
Absorbance (A), známá také jako optická hustota (OD), je množství světla pohlceného objektem a lze ji vyjádřit takto
Propustnost (T)
Chcete-li se dozvědět více o základních znalostech technik UV Vis spektroskopie, stáhněte si příručku "Spectrophotometry Applications and Fundamentals".
Co je Beerův-Lambertův zákon?
Beerův-Lambertův zákon říká, že množství energie absorbované roztokem je úměrné délce dráhy a koncentraci. Jednoduše řečeno, koncentrovanější roztok pohlcuje více světla než roztok zředěný.
Matematické vyjádření Beerova zákona je následující:
A = ϵ.d.c
Kde ϵ = molární absorbance, d = délka dráhy a c = koncentrace. Molární absorbance je jedinečná fyzikální konstanta vzorku, která se vztahuje ke schopnosti vzorku absorbovat světlo dané vlnové délky. Jednotkou ϵ je L-mol-1-cm-1.
Chcete-li se dozvědět více o základech UV Vis spektroskopie, stáhněte si příručku METTLER TOLEDO "Aplikace a základy spektrofotometrie".
Jaký je rozdíl mezi skenovacími a maticovými spektrofotometry?
UV Vis spektrofotometr je přístroj určený k měření absorbance v UV Vis oblasti pomocí Beerova-Lambertova zákona. Měří intenzitu světla procházejícího roztokem vzorku v kyvetě a porovnává ji s intenzitou světla před průchodem vzorkem.
Hlavními součástmi UV Vis spektrofotometru jsou zdroj světla, držák vzorku, disperzní zařízení k oddělení různých vlnových délek světla a vhodný detektor.
Skenovací spektrofotometr
Běžné skenovací spektrofotometry pracují na principu postupného měření transmitance při každé definované vlnové délce. Světlo je rozděleno na různé vlnové délky pomocí difrakční mřížky. Mezi difrakční mřížku a detektor se umístí kyveta se vzorkem.
Spektrofotometr Array
V maticovém spektrofotometru je vzorek osvětlován kontinuem, tj. všemi spektrálními složkami světla najednou, a proto absorbuje světlo různých vlnových délek současně. Prošlé světlo je pak difraktováno reflexní mřížkou. Toto přístrojové vybavení pomáhá získat UV Vis spektrum rychleji, než lze získat pomocí tradičního skenovacího spektrofotometru.
V porovnání se skenovacím spektrofotometrem nemá spektrofotometr s maticí žádné pohyblivé části.
Chcete-li se dozvědět více, stáhněte si článek "Array versus Scanning". Bílá kniha porovnává dvě zavedená uspořádání UV Vis spektrofotometrů a hodnotí jejich výkon a výhody.
Spektrofotometrický přístroj musí fungovat v souladu se svými specifikacemi pro kritická měření UV Vis, zejména v klinické, farmaceutické nebo průmyslové kontrole kvality. Proto je třeba pravidelně ověřovat výkonnost. Výsledky kalibrace musí být rovněž zaznamenány a uloženy.
Stáhněte si knihu "Jak by měly laboratoře UV Vis provádět kalibraci spektrofotometrů", kde najdete informace o významu kalibrace vzhledem k revizím kapitol o UV Vis, které najdete v publikaci Ph. Eur. 10 a USP42 NF37.
Hlavní parametry, které je třeba kalibrovat pro UV vis spektrofotometr
Hlavní parametry, které je třeba kalibrovat u UV Vis spektrofotometru, jsou uvedeny v následující tabulce.
Test výkonu
Certifikovaný referenční materiál (CRM)
Přístroj Zkušební parametr
Kritéria přijatelnosti
USP 42 NF 37
Ph. Eur. 10
Přesnost vlnové délky &
opakovatelnost
Ho(ClO4)3: 4 % Ho2O3 v 10 % v/v HClO4
Slepý pokus: Vzduch
14 vlnových délek
(240 nm - 650 nm)
Xe: 2 vlnové délky (260,6, 528,6 nm)
UV záření (200 - 400 nm): ± 1 nm
Vis (400 - 780 nm): ± 2 nm
(S.D.) < 0,5 nm
UV (< 400 nm):
± 1 nm
Vis (> 400 nm):
(± 3 nm)
Fotometrické údaje
přesnost &
opakovatelnost**
K2Cr2O7 v 0,001 M HClO4
Slepý pokus: 0,001 M HClO4
60 mg/l
0 A - 2 A,
235, 257, 313, 350 nm
Pro absorbance ≤ 1A
Přesnost: ± 0,010A
Opakovatelnost:
S.D. ≤ 0,005 A
Pro absorbanci > 1A
Přesnost: ± 1 %
Opakovatelnost:
S.D. ≤ 0,5%
Přesnost: ± 0,010 A nebo ± 1 %, podle toho, která hodnota je vyšší.
Kyselina nikotinová v
0,1 M HCl
Slepý pokus: 0,1 M HCl
12 mg/l
0,26 A - 1,6 A
213, 261 nm
Fotometrická linearita
K2Cr2O7 v 0,001 M HClO4
Slepý pokus: 0,001 M HClO4
6 - 200 mg/l, do 3,0 A,
235, 257, 313, 350 nm
Všechny měřené filtry splňují kritéria přijatelnosti fotometrické přesnosti .
R2> 0,999
Kyselina nikotinová v
0,1 M HCl
Slepý pokus: 0,1 M HCl
6 - 60 mg/l, do 2,5 A
213, 261 nm
Rozptylové světlo podle postupu A
(SFRM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Délka dráhy 10 mm
Slepý pokus: 1,2 % w/v KCl/H2O, délka dráhy 5 mm.
Amax při 198 nm
≥ 0.7 A
(NA)
Rozptylové světlo podle postupu B (SWM)
1,2 % w/v KCl/H2O;
Délka dráhy 10 mm
Slepá položka: H2O, délka dráhy 10 mm
Amax při 198 nm
≥ 2.0 A
≥ 2.0 A
Rozlišení
0,02 % obj. toluenu v n-hexanu
Slepý pokus: n-hexan/
n-heptan (Ph. Eur. 10)
Amax,269/Amin,267
>1.3
Hladiny jsou uvedeny v příslušné monografii
** Žádná specifikace fotometrické opakovatelnosti (přesnosti) v Ph. Eur.
S.D. - Směrodatná odchylka
3. Věda o barvách
Základy měření barev
Barvy dělají náš svět zajímavějším. Když vidíme nějaký objekt, světlo odražené od objektu vstupuje do našich očí a je zachyceno několika typy fotoreceptorů na sítnici. V závislosti na citlivosti fotoreceptorů mohou různí lidé vnímat stejnou barvu různě.
Abychom mohli univerzálně přijmout přesnost určité barvy, je třeba jí přiřadit číselné hodnoty. Stručně řečeno, měřicí zařízení, jako jsou spektrofotometry a kolorimetry, poskytují výsledky měření barev ve formě hodnot, aby byla zajištěna přesnost a opakovatelnost určení barvy.
Spektrofotometry kvantifikují údaje o barvě sběrem a filtrací vlnových délek procházejících vzorkem. Na spektrální data se aplikuje matematická rovnice, která mapuje barvu na barevnou stupnici.
Barevná stupnice CIE (Commission internationale de l'éclairage) je definována pomocí tří parametrů: odstínu, barvy a světlosti.
Odstín je dominantní barva objektu. Primární a sekundární barvy dohromady tvoří odstín.
Chroma, známá také jako sytost, popisuje, jak živá nebo matná je barva.
Světlost je světelná intenzita barvy (zda je tmavá nebo světlá).
Každý barevný systém CIE používá tři souřadnice pro umístění barvy na stupnici. Tři základní barevné stupnice jsou Tristimulus CIE XYZ, CIE L*a*b* a CIE L*u*v*.
Pokud je například barva vyjádřena v CIE L*a*b*:
L* definuje světlost
a* označuje hodnotu červené/zelené barvy
b* označuje hodnotu žluté/modré
Při použití barevné stupnice CIE L*a*b* by souřadnice červené barvy růže na obrázku byly:
L* = 29,00, a* = 52,48, b* = 22,23.
Chcete-li se dozvědět více o základech měření barev, stáhněte si průvodce.
Barva je klíčovým faktorem pro okamžité rozpoznání.
Poskytnutí celkově úspěšného vizuálního zážitku spotřebitelům může ovlivnit rozhodnutí o koupi. Proto je barva důležitá při definování identity značky a konzistence produktu.
K jednoznačnému definování výrobku podle průmyslových norem jsou zavedeny různé barevné stupnice. Mezi tyto stupnice patří:
Stupnice
Standard
Aplikace
Saybolt
ASTM D156, ASTM D6045
Ke zjištění, zda je palivo (petrolej, benzín, nafta, benzin atd.) kontaminováno nebo zda došlo k jeho degradaci při skladování.
APHA/Pt-Co/Hazen
ASTM D1209
Index žlutosti používaný jako metrika pro kontrolu čistoty ve vodárenském, chemickém, ropném a plastikářském průmyslu.
Gardner
ASTM D1544/D6166, DIN EN ISO 4630-2
Pro testování výrobků, jako jsou pryskyřice, mastné kyseliny, laky a vysychající oleje, které získaly barvu zahřátím.
CIELAB
DIN EN 11664-4, DIN 5033-3, 4630, ASTM Z 58.7.1 DIN 6174
Kontrola kvality pro aromatický a voňavkářský průmysl a potravinářský a nápojový průmysl
Metoda MEBAK 2.13.2, metoda EBC 8.5, metoda EBC 9.6.
K měření intenzity barvy a zákalu (zákalu) v jednotkách EBC piva, sladu, karamelu atd.
USP/EUP
USP-24 Monografie 631, metoda EP 2.2.2
Kontrola kvality léčiv
Hess-Ives
Zkušební metoda DGK F 050.2
Používá se ke zkoušení chemických látek a povrchově aktivních kapalin (zejména v kosmetickém průmyslu).
4. Analýza mikroobjemů pomocí UV vis spektrofotometru
Jak provést analýzu mikrosvěta v UV vis spektroskopii?
Mikroobjemový spektrofotometr měří objemy vzorků již od 1 µl. Koncentrace nukleových kyselin ve vzorku se obvykle pohybuje v řádu nano nebo mikrogramů na mililitr.
Ředění takových mikroobjemů a získávání přesných výsledků je náročné. Proto se pro následnou analýzu nukleových kyselin stává důležitou mikroanalýza bez ředění.
Při analýze nukleových kyselin se mikroobjem vzorku pipetuje do jemné přihrádky na povrchu podstavce. Světelný paprsek ze zdroje lampy je veden vláknovou optikou na plošinu s mikroobjemem. Protože délka dráhy je zkrácena na řádově milimetry, lze přesně analyzovat vyšší koncentrace analytu bez nutnosti vícenásobného ředění.
Systém mikroobjemů využívá technologii vláknové optiky spolu s inherentními vlastnostmi vzorku (např. povrchovým napětím) k udržení vzorku na podstavné plošině a stanovení absorbance vzorků v reálném čase při malých objemech.
Díky těmto výhodám se mikroobjemová analýza stává ideální volbou pro biomolekulární analýzu.
Zúčastněte se webináře na vyžádání "Maximalizace přesnosti pracovního postupu díky správné praxi UV/VIS při analýze nukleových kyselin", kde najdete tipy a triky pro mikroobjemovou analýzu.
Kontrola kvality nukleových kyselin Kvantifikace nukleových kyselin je základní preanalytickou metodou pro získání přesných a spolehlivých výsledků v mnoha molekulárně biologických testech, jako je sekvenování nové generace (NGS), polymerázová řetězová reakce (PCR), PCR v reálném čase (kvantitativní PCR; qPCR), klonování a transfekce.
Kvalitativní a kvantitativní kontrolu nukleových kyselin lze provádět stanovením čistoty a koncentrace nukleových kyselin.
Metody analýzy DNA A260 udává korelaci koncentrace nukleotidů a A280 udává koncentraci zbytkových proteinů. Aminokyseliny tyrosin a tryptofan absorbují při 280 nm a fenylalanin dobře absorbuje při 260 nm. To umožňuje výpočet poměru A260/A280 pro čistotu DNA pomocí přímého měření absorbance. Kvalitní DNA bude mít poměr A260/A280 1,7-2,0.
Testy kvantifikace bílkovin Různé metody kvantifikace celkových bílkovin zahrnují testy A280, kyseliny bikinchoninové (BCA), Bradfordův, Lowryho, Piercův a další nové testy. Bílkoviny v roztocích mají maxima při 280 nm díky aminokyselinám s aromatickými kruhy a minima při přibližně 220 nm díky přítomnosti peptidových vazeb.
Koncentrace se vypočítá pomocí Warburgova vzorce:
Koncentrace bílkovin (mg/ml) = 1,55 X (údaj A280) - 0,76 X (údaj A260).
Chcete-li se dozvědět více o analýze DNA pomocí UV Vis spektroskopie, stáhněte si redakční článek aplikace "Poměr 260/280: Ukazatel kontaminace bílkovinami".
Jaké jsou nejčastější chyby při měření a kalibraci UV viditelnosti?
Dobré přesnosti a preciznosti při měření UV Vis lze dosáhnout, pokud přijmete opatření k zamezení chyb. Mezi typická rizika chyb, která je třeba při měření UV Vis zohlednit, patří:
Spektrální charakteristiky. Spektrální charakteristika se provádí během kalibrace. Hlavními faktory, které mohou vést k chybným výsledkům, jsou přesnost vlnové délky, šířka spektrálního pásma, rozptýlené světlo a linearita.
Fotometrické charakteristiky. Fotometrické charakteristiky zahrnují spektrální citlivost zdroje světla, citlivost zdroje světla a detektoru v závislosti na teplotě atd.
Optické interakce. Záření světelného zdroje může interagovat s materiálem kyvety a měnit intenzitu absorbance vzorku. Těmto optickým interakcím lze zabránit výběrem vhodného materiálu kyvety.
Různé faktory. Měření nepříznivě ovlivňují i další faktory, jako je teplota, kolísání napětí na lince, vibrace, kontaminace nebo zahřívání vzorku fotometrem.
GUVP™
Přestože se nelze vyhnout všem chybám, lze je minimalizovat a dosáhnout tak lepších výsledků.
'Stáhněte si brožuru Správná praxe UV/VIS spektroskopie "Důvěryhodné výsledky UV/Vis spektroskopie".
Výběr správné kyvety zahrnuje výběr správného materiálu a správné velikosti podle vzorku a přístrojového vybavení.
Materiál kyvety by měl mít dostatečnou propustnost při dané vlnové délce. Útlum světla na stěnách kyvety by neměl ovlivnit výsledek analýzy. Skleněné kyvety se nepoužívají v UV oblasti pro analýzu pod 370 nm, protože absorbují záření. Doporučuje se používat je pouze ve viditelné oblasti.
V následující tabulce jsou uvedeny použitelné rozsahy přenosu kyvet:
Materiál
Teoretický rozsah přenosu (nm)
Dálkové UV záření křemen
170-2700
Optické sklo
320-2500
Křemen pro blízké infračervené záření
220-3800
UV křemen
220-2500
UV plast
220-900
Jednorázová PS buňka
340-750
Jednorázová buňka z PMMA
285-750
Na možnosti měření má vliv také velikost kyvet. Jmenovitá délka dráhy záření kyvety je 10 mm. V závislosti na vzorcích lze délku měnit od 1 mm do 100 mm.
Pro většinu studovaných vzorků lze použítstandardní kyvety. Běžné absorpční a fluorescenční kyvety mají vnější základnu 12,5 mm x 12,5 mm, výšku 45 mm a vnitřní rozměry 10 mm x 10 mm.
Kyvety sdlouhou dráhou (kyvety s délkou dráhy větší než 10 mm) se používají v případě, že je vzorek příliš zředěný nebo se vzorek během měření odpařuje či prochází chemickou změnou.
Kyvety skrátkou dráhou (kyvety s délkou dráhy menší než 10 mm) se používají, když je absorbance vysoká a ředění je obtížné.
Jak správně zacházet s kyvetami?
Při manipulaci s kyvetami je vždy přenášejte matnými stranami. Nedotýkejte se prsty průhledných optických ploch, protože otisky prstů mohou způsobit výraznou absorpci a ovlivnit tak přesnost.
K plnění kyvety nepoužívejte skleněné pasteurovy pipety, protože by mohly poškrábat optický povrch a způsobit další interference. Doporučují se pipety s jednorázovými plastovými špičkami.
Čistota kyvet má zásadní vliv na výsledky, proto ji musíme považovat za velmi důležitý faktor.
Pro hloubkové čištění křemenných kyvet se doporučují následující kroky:
Namočte kyvety do čisticího roztoku.
Odstraňte čisticí roztok a kyvety opláchněte deionizovanou vodou.
Kyvety omyjte etanolem nebo acetonem, s výjimkou případů, kdy se jedná o bílkoviny (viz tabulka níže).
Osušte kyvety otřením kapesníkem, který nepouští vlákna, a následným sušením na vzduchu nebo v sušičce.
V následující tabulce jsou uvedeny použitelné rozsahy přenosu kyvet.
Vodné roztoky
Organické molekuly
Obtížně odstranitelné částice
Bílkoviny
Těžké kovy
Mastné kyseliny
Čistící roztoky
Stejné objemové díly 3 M HCl a ethanolu
Promývání 50% kyselinou dusičnou
Koncentrovaná HNO3 nebo 2 M HCl
Stejné objemové díly ethanolu a 3 M HCl
Inkubujte při pokojové teplotě s trypsinem
(Etanol a aceton se k čištění nedoporučují.)
Stejný objemový díl 2 M kyseliny sírové a 50 % deionizované vody
Aqua regia
Stejné objemové díly IPA a deionizované vody
Doba namáčení*
10 minut
10 minut
30 sekund
Přes noc
20 minut
Otřete
*Doba namáčení uvedená v tabulce je hrubým odhadem; doporučuje se však namáčet kyvety pouze do té doby, než se odstraní skvrny/kontaminace.
Skleněné kyvety lze čistit opláchnutím kyvet acetonem nebo ethanolem a následným opláchnutím vodou. Doporučuje se sušení na vzduchu.
Plastové kyvety lze několikrát omýt deionizovanou vodou. Mytí plastových kyvet chemikáliemi se nedoporučuje.
Stáhněte si naši sbírku plakátů s tipy a triky pro udržování čistoty laboratorních přístrojů
Správná praxe pro používání mikroobjemových spektrofotometrů
Příprava vzorku Citlivost přístroje může být nízká u zředěných koncentrací biologických vzorků. Chcete-li zvýšit citlivost takových vzorků, zvažte odběr vzorku o vyšší koncentraci. Pro měření mikroobjemů je obvykle zapotřebí 1-2 µl objemu vzorku. K odběru vzorku použijte kalibrované pipety. Je třeba dbát na to, aby byl připraven homogenní vzorek a odebrán k analýze.
Vyčistěte platformu pro mikroobjem Zajistěte, aby byl povrch podstavce pro mikroobjem a zrcadlo řádně vyčištěny. Povrchy jednoduše otřete deionizovanou vodou pomocí kapesníku, který nepouští vlákna. Používáte-li pufrovací roztok, detergenty nebo lepkavý vzorek, očistěte povrch několikrát, než budete pokračovat s dalším vzorkem.
Umístěte vzorek na plošinu Pomalu a rovnoměrně umístěte vzorek na povrch, abyste zabránili tvorbě bublin.
Pracujte v rámci detekčních limitů Zjistěte si nejnižší a nejvyšší detekční limity přístroje a pracujte v tomto rozsahu.
Obecné postupy pro přesné měření UV viditelnosti
Při přípravě vzorku a jeho pipetování do kyvety nebo na mikrozkumavku buďte opatrní. Vzorek by měl být homogenní.
Pokud jsou ve vzorku přítomny suspendované pevné částice, může dojít k rozptylu světla. V takových případech vzorek přefiltrujte pomocí injekčního filtru.
Vzorek naplňte do kyvety s ohledem na rozměr z držáku vzorku. Tím se zajistí, že světlo prochází vzorkem. z-rozměr je vzdálenost ode dna kyvety do výšky, ve které světelný paprsek prochází vzorkem.
Před každým měřením očistěte kyvetu kapesníkem, který nepouští vlákna. Pokaždé použijte nový kapesník.
Jako slepý vzorek použijte stejné rozpouštědlo/pufr, který byl použit při přípravě vzorku.
6. Jaké jsou aplikace UV vis spektroskopie v různých průmyslových odvětvích?
UV Vis spektroskopie je všestranná analytická technika s širokou škálou využití v různých průmyslových odvětvích. Některé z významných aplikací UV Vis spektroskopie v různých průmyslových odvětvích jsou:
Potraviny a nápoje
UV Vis spektroskopie určuje kvalitu a složení potravin a nápojů. Lze ji použít k analýze barvy (např. vína), chuti a vůně potravinářských výrobků a také ke zjištění přítomnosti kontaminantů nebo příměsí.
Farmaceutické
UV Vis spektroskopie analyzuje čistotu, koncentraci a identitu léčiv a dalších farmaceutických produktů. Používá se také ke sledování stability léčivých přípravků v průběhu času.
Kosmetika
Hodnocení fotostability látek pro přípravky, charakterizace částic UV blokátoru, hodnocení barevného indexu, detekce falšování (parfémový průmysl), studium optických vlastností, kvantifikace barviv, antioxidantů atd.
Petrochemický
Charakterizace ropy, výpočet asfaltenových frakcí, formulace indexů pro obsah aromatických látek, kvalita ropy, obsah síry, výpočet Hildebrandova faktoru rozpustnosti (rozšířeno na bitumeny, těžké a břidlicové oleje a oleje z fluidního katalytického krakování, koksování nebo zkapalňování uhlí).
Chemické
Stanovení chemických vlastností, konečné hodnocení kvality hotového výrobku, studie složení polymerů, kvalifikace odpadních vod, stanovení čistoty a účinnosti barvení, fotokatalytická degradace polymerů/barviv, rezidua pesticidů v půdě nebo vodě.
Biotechnologie
Koncentrace a čistota nukleových kyselin, proteinů (A280, BCA, Biuret, Bradford Lowry, OD 600), měření mikrobiálních buněčných kultur, denaturace proteinů, kinetické studie (enzymatická aktivita), biologické vzorky jako krev, plazma, sérum atd.
METTLER TOLEDO nabízí širokou škálu ověřených aplikačních metod. Najděte si aplikaci, která nejlépe vyhovuje vašim potřebám, prostřednictvím našeho online vyhledávače.
Různé spektroskopické techniky se rozlišují především podle toho, jaké záření používají, jaká je interakce mezi energií a materiálem a pro jaký typ materiálu a aplikace se používají. Spektroskopické techniky běžně používané pro chemickou analýzu jsou atomová spektroskopie, ultrafialová a viditelná spektroskopie (UV Vis spektroskopie), infračervená spektroskopie, Ramanova spektroskopie a nukleární magnetická rezonance.
Typ spektroskopie
Typ záření
Interakce
Vlnová délka
ϒ zářivá spektroskopie
ϒ-záření
Atomová jádra
< 0,1 nm
Rentgenová fluorescenční spektroskopie
Rentgenové záření
Elektrony vnitřního obalu
0,01 - 2,0 nm
Vakuová UV spektroskopie
Ultrafialové záření (UV)
Ionizace
2,0 - 200 nm
UV vis spektroskopie
UV Vis
Valenční elektrony
200 - 800 nm
Infračervená a Ramanova spektroskopie
Infračervená
Molekulární vibrace
0,8 - 300 mm
Mikrovlnná spektroskopie
Mikrovlny
Molekulární rotace
1 mm až 30 cm
Spektroskopie elektronové spinové rezonance
Elektronový spin
Spektroskopie nukleární magnetické rezonance
Rádiové vlny
Jaderný spin
0.6 - 10 m
Jaké jsou různé molekulární interakce v UV oblasti?
Absorpce UV záření vede k elektronickým přechodům z nižších energetických hladin na vyšší. Absorpce ultrafialového záření v organických molekulách je omezena na určité funkční skupiny (chromofory), které obsahují valenční elektrony s nízkou excitační energií. Molekulární přechody/interakce, které probíhají v důsledku absorpce UV záření, jsou následující:
π- π* (přechod z hvězdy pí na hvězdu pí) - vazebný orbital na antivazebný orbital
n - π* (přechod n na hvězdu pí) - nevazebný orbital na antivazebný orbital
Tyto přechody vyžadují nenasycenou skupinu v molekule, která poskytne π elektrony.
Přechody σ (vazebné) na σ* (antivazebné) vyžadují vyšší energii, a proto je nelze detekovat pomocí UV Vis spektroskopie.
Jak funkční skupiny ovlivňují spektrum?
Uvažujme funkční skupinu obsahující atomy s jedním nebo více osamělými páry elektronů, které neabsorbují ultrafialové/viditelné záření. Pokud je však tato funkční skupina připojena k chromoforu, mění intenzitu a vlnovou délku absorpce. Tento jev se nazývá auxochrom nebo skupina zesilující barvu.
Přítomnost auxochromu způsobuje polohový posun píku nebo signálu na delší vlnovou délku, což se nazývá bathochromní nebo červený posun. Funkční skupiny, které přispívají k batochromním skupinám, jsou substituenty, jako jsou methyl, hydroxyl, alkoxy, halogenové a aminoskupiny.
Auxochrom, který způsobuje polohový posun píku nebo signálu na kratší vlnovou délku, se nazývá hypochromní nebo modrý posun. Kombinace chromoforu a auxochromu se vlastně chová jako nový chromofor, který má jiné absorpční maximum (λmax). Například benzen vykazuje λmax při 256 nm, zatímco anilin vykazuje λmax při 280 nm. Skupina NH2 se tedy chová jako auxochrom a způsobuje posun λmax na větší hodnotu.
Jaký je rozdíl mezi šířkou spektrálního pásma a rozlišením v UV vis spektroskopii?
Spektrální šířka pásma (SBW) spektrofotometru souvisí s fyzickou šířkou štěrbiny a optickou disperzí systému monochromátoru. Rozlišovací schopnost je schopnost přístroje rozdělit světlo do konečných, odlišných oblastí vlnových délek a rozlišit každou konečnou oblast. Spektrální šířka pásma se obvykle používá u skenovacích přístrojů, zatímco rozlišení se obvykle používá u přístrojů s maticemi.
Pro většinu lékopisných kvantitativních účelů je dostatečná šířka spektrálního pásma menší než 2 nm a kritérium přijatelnosti pro poměr je 1,3. Spektrální rozlišení lze použít pro srovnání se spektrální šířkou pásma.
V tabulce je uvedeno rozlišení UV/VIS spektrofotometrů METTLER TOLEDO Excellence, které se měří pomocí toluenu v hexanu, a ekvivalentní SBW.
Přístroj
Spektrální rozlišení
Ekvivalentní SBW (nm)
UV5
> 1.5
< 2.0
UV5Bio
> 1.5
< 2.0
UV5Nano
> 1.7
< 1.5
UV7
> 1.9
≤ 1.0
Jaké jsou různé zdroje světla používané v UV Vis spektrofotometru?
Nejlepší zdroj světla je takový, který poskytuje dobrou intenzitu s nízkým šumem ve všech ultrafialových a viditelných vlnových délkách a nabízí stabilitu po dlouhou dobu. Existuje řada světelných zdrojů, které se běžně používají, jak je uvedeno níže.
Zdroj světla
Rozsah vlnové délky
(nm)
Oblast
Životnost
Žárovka s wolframovým vláknem
350 - 2500
VIS + IR
3 000 hodin
Deuteriová oblouková lampa
190 - 400
UV ZÁŘENÍ
1 000 h
Vodíková lampa
190 - 400
UV
1 000 h
Xenonová záblesková výbojka
190 - 1100
UV + VIS + NIR
5 500 hodin*
* Odpovídá 50 Hz zábleskům při konstantním provozu
V čem je difrakční mřížka lepší než hranol?
Prizma a difrakční mřížka jsou typické disperzní prvky. Hranol dosahuje disperze díky rozdílu indexu lomu materiálu v závislosti na vlnové délce. Difrakční mřížka však využívá rozdílu ve směru difrakce pro každou vlnovou délku v důsledku interference. Jak hranoly, tak difrakční mřížky mohou pro analýzu rozložit světelná spektra do mnoha barev. Difrakční mřížka je však méně citlivá na barvu světla a lze ji vyrobit tak, aby rozložila barvy do většího úhlu než hranol. Sklo v hranolu je čiré pro viditelné světlo, ale pohlcuje a blokuje světlo v infračervené a ultrafialové části spektra. Difrakční mřížka s několika stovkami čar na palec může vychýlit světlo ve středu viditelného spektra nejméně o 20 stupňů. Úhel vychýlení skleněného hranolu je obvykle mnohem menší.
Které anorganické sloučeniny lze měřit pomocí UV vis spektroskopie?
Molekuly lze analyzovat pomocí UV Vis spektroskopie, pokud mají nějakou funkční skupinu nebo konjugaci, nebo pokud vytvářejí barevný komplex. Protože anorganické sloučeniny neobsahují žádnou funkční skupinu ani konjugaci, je běžnou metodou jejich analýzy reakce s vhodnou sloučeninou. Vzniká barevný komplex, jehož absorbance může být fotometricky měřena ve viditelné oblasti a korelována s jeho skutečnou koncentrací. Například železo se běžně analyzuje reakcí s 1,10-fentrolinem za vzniku červeného barevného komplexu. Absorbance komplexu se měří při vlnové délce 570 nm, aby se odhadla koncentrace železa.
Jak se liší jednopaprskové a dvoupaprskové spektrofotometry?
Hlavní rozdíl mezi jednopaprskovým a dvoupaprskovým spektrofotometrem je následující.
Jednopaprskový spektrofotometr: Jediný paprsek ze zdroje světla prochází vzorkem.
Dvoupaprskový spektrofotometr: Světelný paprsek ze zdroje světla je rozdělen na dvě části: jedna část prochází vzorkem a druhá část prochází referenčním vzorkem.
Rozdělení paprsku ve dvojitém spektrofotometru se provádí dvěma způsoby:
staticky, pomocí částečně propustných zrcadel nebo podobného zařízení
zeslabením paprsků pomocí pohyblivých optických a mechanických zařízení
Jak analyzovat pevný polymerní film pomocí UV Vis?
Analýza pevného vzorku se provádí především odhadem jeho absorbance, transmitance a reflektance. Mezi běžné parametry stanovené pro pevné polymery patří % transmitance, mezní vlnová délka a index žlutosti. Vzorek se upevní na držák speciálně navržený pro pevné vzorky a odečty se provádějí stejným způsobem jako u kapalných vzorků. Držák pevných vzorků umožňuje měření pevných vzorků, jako jsou filmy nebo sklo.
Má teplota vliv na UV vis analýzu?
Teplota ovlivňuje hodnoty absorbance. Různá rozpouštědla podléhají při různých teplotách různým interakcím. Parametry roztoku, které se mění v důsledku změn teploty, jsou:
Rychlost reakce. Rychlost se mění při zvýšení teploty. To může způsobit změnu aktivity vzorku. Enzymatické/biomolekulární reakce jsou velmi citlivé na teplotu.
Rozpustnost rozpuštěné látky. Rozpustnost je ovlivněna změnami teploty. Špatná rozpustnost může mít za následek nepřesnou absorpci.
Rozpínání nebo smršťování rozpouštědla. To může vést ke změně koncentrace roztoku a ovlivnit absorbanci, protože absorbance je lineárně závislá na koncentraci.
Schlierenův efekt. Tento efekt se může objevit při změnách teploty, což vede k řadě konvektivních proudů, které mohou změnit skutečnou absorbanci.
Parametry optického výkonu, jako je fotometrický šum, přesnost/opakovatelnost vlnové délky, fotometrická opakovatelnost a rozptýlené světlo, nejsou v rozmezí 10-40 °C ovlivněny teplotou.
Zatímco optické parametry, jako je fotometrické rozlišení (poměr toluen/hexan) a fotometrická přesnost vlnových délek (K2Cr2O7 v HClO4), vykazují závislost na teplotě v rozmezí od 0,014 do -0,034/jednotku v rozmezí 10 - 40 °C.
Řízení teploty pro UV Vis spektrofotometrii lze dosáhnout pomocí vysoce výkonných termostatických systémů, jako jsou CuveT a CuvetteChanger. Více informací naleznete zde.
Co je rozptýlené světlo?
Rozptýlené světlo je definováno jako světlo, které dopadá na detektor a které nepochází ze zdroje světla přístroje a nesleduje optickou dráhu, což způsobuje odchylku na odpovídající vlnové délce. Proto je intenzita světla naměřená detektorem vyšší, než by ve skutečnosti měla být. Naopak to také znamená, že naměřená absorbance je nižší než skutečná absorbance, protože je snížena o příspěvek rozptýleného světla. Tento efekt je výraznější při vyšších hodnotách absorbance (vysoké koncentrace vzorku).
Stáhněte si whitepaper a zjistěte více o původu a přesném měření rozptýleného světla:
Proč je prostor pro vzorek v UV Vis Array spektrofotometrech otevřený?
Prostor pro vzorek je u spektrofotometrů s UV Vis maticí otevřený, protože přístroje s maticí používají reverzní optiku a simultánní detekci všech vlnových délek spektra.
Reverzní optika: Světlo se rozptyluje poté, co projde vzorkem. Díky tomu se na signálu v dané oblasti vlnových délek podílí pouze malá část vnějšího okolního světla.
Současná detekce: Pomocí maticového detektoru, který poskytuje 2048 signálů o intenzitě světla současně, je celé spektrum zaznamenáno během jedné sekundy. Protože je měření velmi rychlé, je vliv okolního světla výrazně omezen.
Aplikace
Níže si stáhněte specifické aplikační příručky pro UV Vis spektroskopii.
